Влияние структуры фотосенсибилизаторов на связывание с человеческим сывороточным альбумином

Актуальность темы

Фотодинамическая терапия рака − это один из нехирургических способов лечения рака и предраковых состояний. Метод основан на способности фотосенсибилизаторов, специальные вещества, вводимые в организм человека внутривенно, при облучении светом определённой волны уничтожать раковые клетки. Подбор фотосенсибилизатора является важным этапом проведения ФДТ. Именно эти химические вещества обеспечивают эффективность и безопасность метода. При этом для каждого фотосенсибилизатора существует свой подходящий тип света, как правило, соответствующий его спектру поглощения.

Важным этапом при разработке фотосенсибилизаторов является изучение взаимодействия противоопухолевого лекарственного средства с белками-переносчиками. Тщательный выбор эффективного фотосенсибилизатора для лечения конкретного заболевания очень важен. Характер фотосенсибилизатора существенен с точки зрения его клеточной локализации, биораспределения в организме и терапевтической эффективности. Для изучения были взяты два препарата относящихся к различным классам хлорины и бактериохлорины, но с одинаковыми периферическими заместителями. Отличие данных структур от большинства других ФС − в их крайне высокой степени накопления в опухолевых клетках in vitro (~100, в то время как обычные ФС характеризуются показателем 3~6). Наличие терминальной аминогруппы, способной к протонированию в кислой среде, а также разница в классе ФС могут значительно повлиять на связывание.

Цель

Изучение связывания двух ФС на основе хлорофилла а и бактериохлорофилла а с человеческим сывороточным альбумином для определения влияния периферических заместителей и выбора наиболее перспективного соединения для применений в ФДТ.

Описание

Для исследования взаимодействия ФС-белок могут быть использованы различные методы: флуоресценция, УФ-видимая спектроскопия, ИК-Фурье спектроскопия. Характерной особенностью хлоринов и бактериохлоринов является их способность поглощать свет, что даёт возможность исследовать данные Кс с помощью спектрофотометрии. Предварительно для исследуемых соединений были определены коэффициенты экстинкций для дальнейшего определения концентрации ФС в растворе по закону Б-Л-Б (стандартной методикой).

Было исследовано связывание двух структурно родственных соединений – FB(4) и BFB(4) с ЧСА с концентрациями 1,7×10-4 и 5,5×10-6 М соответственно. Связывание изучали с помощью абсорбционной спектроскопии. У исследуемых соединений имеется терминальная аминогруппа, следствием чего является зависимость их гидрофобности от кислотности среды.

FB(4) в фосфатном буфере не обладает тенденцией к агрегации. Добавление данного соединения к различным концентрациям ЧСА в диапазоне от 0 до 10-4 М приводило к трансформации спектров поглощения. Наблюдалось увеличение оптической плотности полосы Соре при 406 нм и Q-полосы при 664 нм, что соответствует типичному связыванию порфиринов с ЧСА. По данным изменениям спектров поглощения рассчитаны и построены кривые связывания, где θ – доля связанных молекул.

При рН 5.0 происходит протонирование терминальной аминогруппы, что может повлиять на связывание обоих ФС в момент нахождения в кислой среде опухолей. Таким образом, для выбора более подходящего ФС необходимо провести связывание с ЧСА при низких значениях pH.

При проведении связывания FB(4) с ЧСА при pH 5.0 изменений в спектральной картине не наблюдалось, общий характер графиков схож с вышеописанным опытом при pH 7.0. Однако рассчитанная КС составила 5×106 М-1, что на порядок выше, при нейтральной среде.

В свою очередь, аналогичный эксперимент для BFB(4) показал ещё большее смещение в сторону мономер-агрегат с образованием аналогичных максимумов в области Q-полосы: 754 нм, отвечающий мономерной форме соединения, и 779 нм, что соответствует поглощению агрегированных структур бактериохлорина. Полное смещение равновесия в системе мономер-агрегат происходит лишь в предельных концентрациях белка (C¬ЧСА - 1×10¬4 М). Рассчитанная КС составила 5×104 М-1, что на порядок ниже при нейтральной среде.

Для выбора перспективного ФС существуют критерии. Главным критерием является диапазон Кс при различных pH. При очень высоком связывании препарат просто не будет накапливаться в опухолевых клетках, при низком − будет выпадать в микроокружении опухоли, что не позволит провести эффективное фотодинамическое действие. Верхним переделом КС является значение 107 М-1, свойственное гематопорфирину, порфирину, который придаёт крови красный цвет; нижний предел должен быть выше 102 М-1, чтобы препарат мог успешно проникнуть в опухоль. Последним критерием является концентрация ФС; при одинаковом связывании перспективнее тот препарат, которого введут меньше.

Таким образом, BFB(4) является лидером по всем трём критериям. Для достижения одинаковой эффективности с FB(4), BFB(4) необходимо взять почти в 100 раз меньше, а в кислой среде обладает достаточным связыванием для удачного накопления в опухолях in vivo. В нейтральной среде оба ФС показывают удовлетворительные значения, однако FB(4) в кислой среде показывает слишком высокое связывание, коррелирующее с предельным значением, что не позволит препарату даже при высокой концентрации накопиться в опухолевых клетках в испытаниях in vivo.

Результат

•        Изучены принципы фотодинамической терапии рака;

•        Изучены особенности классов ФС применяемых в ФДТ;

•        Проведена оценка влияния строения ФС на связывание с ЧСА;

•        Проведено связывание ФС с белком при различных условиях;

•        Сделан вывод о более перспективном агенте для применения в ФДТ.

Оснащение и оборудование

Оборудование: спектрофотометр Shimadzu 3101, магнитная мешалка, вортекс, кюветы, круглодонные колбы, химические стаканы, центрифужные пробирки.

Материалы: хлорин FB (4), бактериохлорин BFB (4), ЧСА, DMSO (sigma Aldrich), фосфатный буфер.

Перспективы использования результатов работы

BFB(4) можно считать перспективным ФС для ФДТ, а дальнейшее изучение in vivo покажет связь между смоделированным связыванием и реальным распределением препарата в организме.

Сотрудничество

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «МИРЭА − Российский технологический университет».

Награды/достижения

Четвёртая научно-техническая конференция студентов и аспирантов РТУ МИРЭА, школьная сессия – победитель.

Всероссийская научно-практическая конференция школьников по химии, 2019 год – диплом III степени.

Особое мнение

«Участие в этой конференции позволило проверить себя и убедиться в том, что ты не отстаёшь от развития науки в целом, дало возможность увидеть свои «слабые места», над которыми нужно как следует поработать. Мне понравилось, что все доклады массово обсуждались и отстаивались докладчиками. Я получила бесценный опыт»