Создание и изучение свойств липофильного диамина с потенциальной противоопухолевой активностью

Актуальность исследования

Рак − злокачественная опухоль, быстро увеличивающаяся в размерах и распространяющая по организму метастазы на поздних стадиях заболевания. Эта опасная болезнь − одна из наиболее распространённых в наше время. Несмотря на успех фармацевтической индустрии в разработке новых противоопухолевых агентов, заболеваемость раком является причиной ежегодной смерти большого количества населения.

Одним из основных подходов лечения онкологических заболеваний является химиотерапия, которая позволяет уничтожить раковые клетки. Химиотерапия применяется как самостоятельное лечение, так и в комбинации с другими методами.

Цель

Целью работы являлся синтез липофильного диамина – потенциального противоопухолевого агента, который является аналогом липофильных полиаминов. Предполагалось, что понижение заряда в молекуле агента незначительно снизит цитотоксичность соединения и повысит селективность действия.

Проблема исследования

В области химиотерапии существует ряд проблем, такие как высокая степень побочных реакций, которые влекут за собой негативные последствия, причиной тому служит недостаточная селективность и высокая токсичность препаратов; а также возникновение лекарственной устойчивости раковых клеток во время терапии. Поэтому разработка новых противоопухолевых веществ является актуальной на сегодняшний день.

Задачи

1. Синтез липофильного диамина с потенциальной противоопухолевой активностью.

2. Подбор оптимальных условий для очистки промежуточных соединений.

3. Изучение свойств целевого и промежуточных соединений.

Описание работы

Катионные глицеролипиды с простой эфирной связью являются перспективными противоопухолевыми кандидатами в препараты для терапии рака. Этот класс соединений получен химической модификацией высокоактивного фосфорсодержащего глицеролипида − Эдельфозина.

По сравнению с другими химиотерапевтическими агентами катионные липиды не мутагенны и не вызывают разрушение эритроцитов (гемолиз).

В литературе описаны поликатионные глицеролипиды − липофильные производные полиаминов (содержащие 4 заряда в молекуле), которые тоже проявляют противоопухолевую активность. Их токсичность для раковых клеток больше по сравнению с монокатионными глицеролипидами, однако это негативно сказалось на селективности действия.

В соответствии с этим были сделаны следующие заключения.

1. Катионностью глицеролипиды обладают благодаря наличию в их структуре аминогрупп.

2. Повышение заряда в молекуле глицеролипида способствует увеличению противоопухолевой активности, но отрицательно влияет на селективность действия.

3. В продолжение исследований в области глицеролипидов предложено понизить заряд путём сокращения количества аминогрупп с целью изучения взаимосвязи структура−активность.

Для выявления взаимосвязи структура−активность было предложено получить соединение с двумя зарядами в молекуле.

Синтез липофильного диамина заключался в первоначальном раскрытии оксиранового цикла и присоединении диамина. Затем вводили защиту по аминогруппам во избежание присоединения на следующей стадии этильных заместителей по аминогруппам. На третьей стадии модифицировали полученное производное этильной группой по С(2) положению глицеринового каркаса, а на завершающем этапе удаляли защитные группы.

На первом этапе проводили раскрытие оксиранового цикла действием трёхкратного избытка N,N-диаминооктана в присутствии трифлата кальция в безводном ацетонитриле. Ход реакции контролировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Через 16 часов от начала реакции в реакционной смеси отсутствовал исходный гексадецилглицидиловый эфир. Продукт данной реакции является очень полярным соединением, что осложняет его выделение с помощью колоночной хроматографии на силикагеле. Поэтому после обработки методом экстракции полученную реакционную смесь использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

На втором этапе вводили по аминогруппам соединения 3 трет-бутоксикарбонильные защитные группы действием трёхкратного избытка Boc2O в дихлорметане в присутствии триэтиламина. Триэтиламин в реакции использовался для связывания образующейся кислоты (трет-бутоксиметановая кислота), поскольку Boc-защитная группа неустойчива в кислых условиях. Через 10 часов от начала реакции результат ТСХ указали на отсуствовие исходного соединения. После обработки реакции экстракцией в системе дихлорметан-вода проводили очистку методом колоночной хроматографии в системе толуол-ацетон (10:1). Однако данная система не позволила провести полную очистку, после колоночной хроматографии была выделена смесь трёх веществ. Поэтому был проведён поиск оптимальной системы растворителей для разделения смеси. В системе толуол-метилэтилкетон (20:1) удалось разделить три соединения, которые оказались N,N-ди(трет-бутоксикарбонил)диаминооктан, целевое соединение 4, а также его производное, содержащее одну Boc-группу. Структуры соединений были подтверждены методом ЯМР-спектроскопии.

На третьем этапе проводили введение этильных групп по С(2) положению диглицерида соединения 4 путём предварительного получения алкоголята натрия при кипячении в третрагидрофуране, а затем действием 3-кратного избытка бромэтана при 24 °С. Через 16 часов хроматограмма указала на отсутствие исходного соединения 4 в реакционной смеси. Хроматографическая подвижность продукта реакции и исходного соединения оказались близки. После концентрирования реакционной массы на роторном испарителе очистку проводили колоночной хроматографией на силикагеле элюируя системой толуол-метилэтилкетон (20:1).

На завершающем этапе синтеза проводили удаление Boc-защитных групп в кислых условиях под действием HCl в диоксане в дихлорметане. В ходе реакции наблюдалось помутнение раствора, поскольку продукт реакции − более полярное соединение. Контроль протекания реакции проводили ТСХ, которая через 1 ч указала на отсутствие в реакционной смеси исходного соединения 5. Далее реакционную смесь концентрировали выдуванием растворителя аргоном и сушили с использованием глубокого вакуума. Очистку проводили перекристаллизацией в диэтиловом эфире, получая целевое соединение 6 с выходом 90 %. Таким образом, в результате выполненной работы был получен липофильный диамин в четыре стадии в количествах 13 мг.

Результаты

1. Изучена область исследований катионных глицеролипидов и липофильных полиаминов перспективных противоопухолевых агентов.

2. Осуществлён синтез липофильного диамина в 4 стадии.

3. Подобраны оптимальные условия очистки промежуточных соединений.

Для соединений с близкой хроматографической подвижностью данного класса соединений оптимально использовать систему растворителей толуол-метилэтилкетон.

4. Изучены свойства целевого и промежуточных соединений (агрегатное состояние, хроматографическая подвижность, доказана структура соединений).

5. Получен липофильный диамин в количествах, достаточных для проведения первичных биологических исследований.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

Посуда: стаканы (50 мл, 100 мл, 250 мл), плоскодонные (10 мл, 25 мл, 250 мл, 500 мл) и круглодонные колбы (10 мл, 25 мл, 50 мл, 100 мл, 250 мл), насыпные воронки, химические воронки, мерные цилиндры (10 мл, 25 мл, 100 мл, 250 мл), делительные воронки (50 мл, 100 мл), пипетки мерные градуированные (0.1 мл, 1 мл, 2 мл, 5 мл, 10 мл), пипетки Пастера стеклянные и пластиковые, шприц (1 мл) с иглой, камера для тонкослойной хроматографии, пузырьки (15 мл), пробки стеклянные и пластиковые, хлоркальциевые трубки, аллонжи, холодильники, дефлегматор, колонки для хроматографии, клипсы металлические, штативы и лапки.

Оборудование: роторный испаритель, магнитная мешалка с подогревом, аналитические весы, компрессор, сушильный шкаф, фен строительный, УФ-лампа, компьютер.

Награды/достижения

Межрайонный этап Московского городского конкурса исследовательских и проектных работ 2019 – победитель.

Сотрудничество с вузом при создании работы

РТУ МИРЭА.

Перспективы развития результатов работы

В результате выполненной работы был получен липофильный диамин в количествах 13 мг, которых достаточно для проведения первичных исследований биологической активности. В дальнейшем для полученного диамина будет проведена оценка цитотоксичности в НИИ Канцерогенеза РОНЦ им Н.Н. Блохина.

Особое мнение

«Главное преимущество моей работы − актуальность. Поиск новых противоопухолевых соединений является важной задачей, поскольку в наше время рак − одна из наиболее распространённых болезней. В настоящий момент в клинических условиях не используются химиотерапевтические препараты, вызывающие минимальное количество побочных эффектов. Кроме того, для раковых клеток характерно возникновение резистентности (устойчивости) к химиотерапевтическим препаратам.

Работая над синтезом и изучением свойств липофильного диамина, я узнала много важной информации и получила полезные навыки.

Конференция «Инженеры будущего» позволяет познакомиться с проектами разных направлений, с новыми научными идеями, получить опыт выступления на публике»