Исследование влияния замещения ионов Ca2+ на Sr2+ на биологическую совместимость октакальций фосфата in vitro

Актуальность

Разработка остеопластических материалов на основе синтетических кальцийфосфатных соединений, равных по эффективности аутографтам костной ткани, является одной из наиболее востребованных задач современной тканевой инженерии. Однако прямая или опосредованная цитотоксичность, ограниченная биосовместимость и неспособность к полноценной биоинтеграции в организме реципиента являются основными ограничивающими факторами для широкого применения кальцийфосфатной карамики в современной клинической практике. Поэтому переход к синтезу КФС в физиологических условиях и разработка биомиметических материалов с использованием биоактивных синтетических аналогов естественного процесса биоминерализации костной ткани – прежде всего ОКФ – открывают новые перспективы для разработки и применения остеопластических композитов с высоким регенеративным потенциалом.

Цель

Исследование влияния замещения ионов Ca2+ на Sr2+ на биологическую совместимость октакальций фосфата in vitro.

Задачи

1. Установить характер влияния Sr-замещённого ОКФ (ОКФ-Sr) на жизнеспособность мезенхимальных клеток in vitro.

2. Изучить влияние Sr-замещённого ОКФ (ОКФ-Sr) на изменение митохондриального потенциала (ΔΨm) в мезенхимальных клетках in vitro.

3. Определить изменение содержания кислых компарментов (лизосом) в мезенхимальных клетках после их инкубации с Sr-замещённого ОКФ (ОКФ-Sr) in vitro.

4. Оценить влияние Sr-замещённого ОКФ (ОКФ-Sr) на внутриклеточную продукцию активных форм кислорода (АФК) мезенхимальными клетками in vitro.

Описание

В настоящее время перспективным подходом в стоматологической и ортопедической реконструктивной хирургии является использование КФС-материалов, полученных в результате синтеза в условиях, близких к физиологическим, т. е. при температуре 35–37 °С и нормальном давлении. Данные композиты могут оказывать прямое индуцирующее действие. На начальных этапах работы, изучив литературу, выяснили положительные и негативные характеристики ДКФД, ГАП и ОКФ. Было установлено, что ОКФ, в отличие от других аналогов, обладает высокой скоростью резорбции и выраженным остеоиндуктивным потенциалом. На данный момент нерешённой задачей является повышение биологических свойств октакальций фосфата, которые предлагается улучшить заменой кальция стронцием.

Коллегами из института металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова РАН была проведена оценка влияния замещения кальция стронцием на фазовые и структурные изменения в материале (ОКФ). С помощью рентгенофазового анализа было установлено следующее.

Кристаллы укрупнялись с увеличением концентрации стронция в материале (ОКФ), по форме приближаясь к пластинчатым. Более высокая степень кристалличности наблюдалась в ОКФ-Sr_5, ОКФ-Sr_10 и ОКФ-Sr_20.

Далее для определения пористости структуры и морфологии поверхности образцов ОКФ и ОКФ-Sr порошки подвергались обработке инфракрасной спектроскопей (ИК-спектроскопии) и сканирующей электронной микроскопией (СЭМ). В свою очередь, макропористость порошков является важным пунктом, влияющим на скорость процесса и качество преобразования трансплантата в кость. С помощью вышеуказанных методов было показано, что с увеличением содержания стронция в материале морфология ОКФ становилась неравномерной; в случае ОКФ – Sr_50 кристаллы имели широкопластинчатую форму, шероховатые края и развитую поверхность.

Следовательно, повышение концентрации Sr в ОКФ стабилизирует его структуру. При минимальном содержании стронция форма образцов октакальций фосфат (ОКФ) по своей макроструктуре была близка к дикальцийфосфату дигидрату (ДКФД), являющемуся нестабильным материалом за счёт крайне быстрой скорости резорбции в нейтральной среде (pH=7), негативно влияющей на качество новобразующейся кости.

Процесс репаративной остеорегенерации начинается с усиления пролиферативной активности остеобластов. Катионы Sr 2+ оптимизируют остеоинтеграцию на начальных этапах, а также обусловливают формирование кости посредством активации остеобластов. Следовательно, на основе фосфатов кальция можно получать материалы, обладающие высокой биоактивностью. В дальнейшем для оценки повышения биологической совместимости полученных низкотемпературным способом композитов на основе октакальций фосфата проводился ряд исследований in vitro по определению характера влияния нативного и стронций-замещённого ОКФ на жизнеспособность и основные события клеточной гибели: продукцию активных форм кислорода (АФК), изменение митохондриального потенциала и лизосомального объёма мезенхимальных стромальных клеток.

Результаты работы/выводы

1. Доказано, что замещение кальция на стронций от 20 % и выше в составе ОКФ может существенно снижать цитотоксичность нативного ОКФ.

2. Установлено, что снижается митохондриальный мембранный потенциал, независимо от степени замещения Ca²⁺ на Sr²⁺ в материале, но данный эффект не коррелирует с влиянием нативного ОКФ и ОКФ-Sr на жизнеспособность клеток.

3. Определено, что ОКФ-Sr, в отличие от нативного ОКФ, не увеличивает количество лизосом, однако данный эффект также не коррелирует с влиянием материалов на выживаемость клеток.

4. Показано, что большинство исследуемых ОКФ-Sr, как и нативный ОКФ, не изменяли конститутивную продукцию АФК, однако октакальций фосфат со степенью замещения Ca²⁺ на Sr²⁺  на 50 % снижал  продукцию активных форм кислорода АФК в клетках C3H/10T1/2.

Перспективы использования результатов работы

Полученные данные представляют интерес не только относительно фундаментальной биологии и медицины, но и с точки зрения прикладной науки. Они описывают возможные механизмы влияния замещения ионов Ca 2+ на Sr 2+ на биологическую совместимость in vitro октакальций фосфата, а также показывают новый подход в повышении биосовместимости кальцийфосфатных соединений и, как следствие, дают основу для разработки и создания новых эффективных остеопластических материалов.

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

Институт металлургии и материаловедения им. А.А. Байкова РАН;

Институт ФГБУН;

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН