Разработка экспресс-теста на глютен методом иммунохроматографического анализа

Работа призёра открытой городской научно-практической конференции «Инженеры будущего» по направлению «Инженеры» в секции «Прикладная химия, физическая химия» среди работ учащихся 10–11 классов

Направление работы: Фармацевтика

Авторы работы: ГБОУ Школа № 544

Email: Написать

Предметы: Биология, Химия

Классы: 11 класс

Мероприятия: Открытая городская научно-практическая конференция «Инженеры будущего» по направлению «Инженеры» 2022 года

Актуальность

Глютен – особый растительный белок, содержащийся в семенах злаковых растений, в выпечке и прочих продуктах питания. Целиакия – генетически предрасположенная непереносимость глютена.

В настоящее время единственным доступным лечением этого состояния является строгая пожизненная безглютеновая диета, которая, несмотря на то что она безопасна и часто эффективна, связана с рядом проблем. [4].

Некоторые люди самостоятельно ставят себе диагноз непереносимости глютена при отсутствии у них целиакии, что создаёт спрос на экспресс-тесты.

Иммунохроматографический метод широко используется в клинической практике. Преимуществом метода является быстрота и лёгкость его применения, возможность использования неприборных форматов ИХА с визуальной оценкой результата анализа. В этом случае не требуется использование никакого оборудования, анализ может быть проведён неспециалистом в любых условиях.

Цель

Разработать экспресс-тест на глютен методом иммунохроматографического анализа.

Задачи

Получить золотохлороводородную кислоту (ЗХВК).
Получить частицы золота.
Подобрать оптимальные условия для определения нужной концентрации антител на частицах коллоидного золота.
Подобрать правильную концентрацию для первичных и вторичных антител.
Получить иммунохроматографический композит.

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

Термостат
Магнитная мешалка со встроенной нагревательной плиткой
Аналитические весы
Автоматические пипетки
pH-метр
Инкубатор
Спектрофотометр (imark bio rad)
Лабораторная посуда

Описание

Химические реакции автор проводил с помощью методов спектрофотометрии и количественного анализа.

Получение золотохлороводородной кислоты (ЗХВК)

Приготовление ЗХВК в «царской водке»: золото массой 0,5875 г залили раствором соляной кислоты объёмом 20 мл, затем по каплям добавляли азотную кислоту до прекращения выделения газа. Золото полностью растворилось. Избыток HNO₃ и HCl удаляют упариванием, полученный раствор разбавляют до требуемой концентрации.

Au + HNO₃ + 4HCl -> H[AuCl₄] + NO + 2H₂O

Рис. 1. Раствор ЗХВК

Получение коллоидного золота

Растворы коллоидного золота получали по методу Френса. Приготовили 1%-й водный раствор цитрата натрия. От объёма цитрата натрия зависит диаметр частиц. Объём находили по формуле:

где V – объём цитрата натрия, d – диаметр наночастиц.

В колбу с магнитной мешалкой добавляли 99 мл дистиллированной воды и 1 мл 1%-го раствора ЗХВК. Раствор нагревали до кипения, после чего быстро при перемешивании добавляли 1,6 мл 1%-го водного раствора цитрата натрия. Раствор кипятили ещё 15 мин при перемешивании (рис. 2), затем охлаждали до комнатной температуры в тёмном месте.

Рис. 2. Синтез коллоидного золота

Определение оптимальных условий сорбции антител на наночастицах золота

Оптимизацию проводили на 96-луночном полистироловом планшете. На планшете выбирали 8 рядов, в каждом из которых было по 6 лунок. Каждый ряд соответствовал фиксированному значению рН, а каждый столбец – определённой концентрации антител. В аликвотах (по 2,5 мл) суспензии коллоидного золота доводили рН до значений в диапазоне от 5,5 до 9,0 с шагом 0,5, добавляя 0,1 М раствора карбоната натрия (рис. 3).

Рис. 3. Растворы коллоидного золота при различных значениях pH

В лунки планшета вносили по 200 мкл растворов коллоидного золота с соответствующими значениями рН и по 20 мкл растворов антител с концентрациями 0, 30, 60, 120, 180, 360 мкг/мл в дистиллированной воде (рис. 4).

Рис. 4. Коллоидное золото, смешанное с раствором антител разной концентрации

Планшет инкубировали 15 мин при перемешивании и добавляли по 50 мкл 10%-го раствора хлорида натрия. Измеряли оптическое поглощение в лунках планшета на длинах волн 520 и 580 нм (Таблицы 1 и 2).

Таблица 1. Значение pH раствора коллоидного золота при различной концентрации антител (520 нм)

C, мкг/мл\pH	5,5	6	6,5	7	7,5	8	8,5
360	0,056	0,063	0,061	0,063	0,059	0,057	0,055
180	0,057	0,069	0,061	0,061	0,055	0,054	0,081
120	0,054	0,061	0,064	0,062	0,059	0,057	0,054
60	0,052	0,071	0,067	0,056	0,055	0,054	0,055
30	0,065	0,058	0,064	0,06	0,056	0,056	0,056

Таблица 2. Значение pH раствора коллоидного золота при различной концентрации антител (580 нм)

C, мкг/мл \pH	5,5	6	6,5	7	7,5	8	8,5
360	0,056	0,062	0,061	0,063	0,059	0,057	0,054
180	0,056	0,067	0,06	0,061	0,054	0,053	0,078
120	0,054	0,06	0,063	0,061	0,057	0,057	0,052
60	0,052	0,071	0,063	0,056	0,054	0,053	0,053
30	0,063	0,058	0,062	0,06	0,055	0,056	0,056

Максимум на графике соответствует оптимальному условию сорбции антител. При обоих длинах волн (520 и 580 нм) оптимальным условием является pH раствора 8,5 и концентрация антител 180 (Графики 1 и 2).

Результаты работы/выводы

По итогу работы были получены частицы золота и определены оптимальные условия сорбции антител: pH = 8,5, концентрацией 180 при длине волны 520 нм; pH = 8,5, концентрацией 180 при длине волны 580 нм.

Перспективы использования результатов работы

Дальнейшие исследования заключаются в определении правильной концентрации первичных и вторичных антител, а также в получении иммунохроматографического композита.

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

Детский технопарк «Альтаир» (МИРЭА – Российский технологический университет)