Иммобилизованный фотопереключаемый флуоресцентный белок как основа для носителя информации

Флуоресцентные белки – это семейство белков, способных поглощать свет определённой длины волны и испускать свет в более длинноволновой области. Родоначальник большинства используемых белков – зелёный флуоресцентный белок (GFP) из медузы Aequorea victoria.

Фотоактивируемые флуоресцентные белки (ФАФБ) представляют собой отдельный класс белков, чьи флуоресцентные свойства могут быть изменены с помощью импульса света определённой длины волны. Становясь флуоресцентными или меняя цвет, ФАФБ могут служить фотометками конкретных белков, органелл, клеток и тканей.

Один из таких белков, Dendra 2, был разработан в лаборатории биофотоники ИБХ РАН под руководством К.А. Лукьянова. Исходно белок Dendra 2 является зелёным флуоресцентным белком.

Одним из перспективных направлений использования белков является создание носителя информации на основе фотоактивируемого или фотопереключаемого флуоресцентного белка. Использование современных технологий, позволяющих активировать отдельные молекулы, позволит существенно увеличить плотность информации, в том числе за счёт использования трёхмерных носителей. Проект посвящён созданию модельного носителя информации на основе фотопереключаемого флуоресцентного белка Dendra 2 и изучению его свойств.

Цель работы: получение модельного носителя информации на основе фотопереключаемого флуоресцентного белка Dendra 2.

1. Трансформация E.coli для получения штамма-продуцента флуоресцентного белка Dendra 2.
2. Культивирование штамма-продуцента флуоресцентного белка Dendra 2.
3. Очистка флуоресцентного белка Dendra 2 при помощи металл-аффинной хроматографии.
4. Фиксация белка Dendra 2 в геле.
5. Пробное переключение флуоресцентного белка Dendra 2 в геле.
6. Отработка условий химической пришивки флуоресцентного белка Dendra 2 к полиакриамидному гелю.
7. Отработка условий переключения флуоресцентного белка Dendra 2, химически связанного с полиакриамидным гелем.
8. Отработка условий визуализации и регистрации сигнала на конфокальном микроскопе Leiсa.

Содержание работы

Работа выполнялась в период сентябрь–декабрь 2018 года в лаборатории биофотоники ИБХ РАН.

Плазмида, кодирующая белок Dendra 2 (pQE-Dendra2, содержит ген устойчивости к ампициллину), любезно предоставлена д. б. н. К.А Лукьяновым.

Для получения штамма-продуцента использовали компетентные клетки E.сoli штамма XL1 Blue производства компании Евроген. Трансформация проводилась по протоколу производителя.

Полученный клон переносили в жидкую среду LB с ампициллином и культивировали сутки при 37 °С и 220 оборотах в минуту. Биомассу штамма-продуцента отделяли от среды центрифугированием и лизировали при помощи ультразвука в буфере PBS. Лизат осветляли центрифугированием и наносили на смолу TALON (Clontech, США), уравновешенную тем же буфером PBS. После пятикратной промывки белок элюировали раствором 100 мМ ЭДТА в PBS.

Полученный белок иммобилизовали в полиакриамидном геле в трёх вариантах: интактный белок, белок, предварительно проинкубированный в течение часа с акрилоил Х в концентрации 1 и 2 %.

Для приготовления полиакриамидного геля использовали 60 %-й раствор смеси акриамид-бисакриламид (соотношение 9:1, конечная концентрация 36−38 %), буфер трис – HCl, pH 7.5 (конечная концентрация 50 мМ), инициаторы полимеризации TEMED и персульфат аммония (конечная концентрация 0,1 % каждого). Компоненты для полимеризации смешивали с белком и заливали образец между предметным и покровным стеклом. После полимеризации проводили эксперименты по фотопереключению иммобилизованного белка на конфокальном микроскопе Leica DM IRE 2.

Для возбуждения зелёной формы и фотопереключения использовался лазер с длиной волны испускаемого света 488 нм, для возбуждения красной формы использовался лазер с длиной волны испускаемого света 555 нм.

Выводы

Было проведено три эксперимента. В первом белок был зафиксирован в геле без химической сшивки белка и геля. В этом случае фотопереключение белка проходило успешно, однако белок диффундировал, и фотоактивированные зоны расплывались. Во втором эксперименте был использован специальный агент для сшивки белка и геля, акрилоил Х в концентрации 2 %. После инкубации в течение часа белок утрачивал способность к фотопереключению. В третьем эксперименте концентрация акрилоил Х была уменьшена до 1 %. При этом фотопереключение проходило успешно, и активированные зоны оставались стабильными.

Пример переключения белка Dendra 2 в геле из зелёного в красный

Полученные результаты подтверждают возможность использования фотопереключаемых флуоресцентных белков как основы для носителя информации.

Перспективы использования результатов работы

Создание многомерной стабильной матрицы.

Стабилизация сигнала в течение длительного времени.

Уменьшение диаметра разжигания до нескольких нанометров.