Идентификация хвоща полевого в сухом чайном напитке с помощью ДНК-маркёра

Актуальность

Анализ нуклеотидной последовательности области ITS позволяет идентифицировать вид лекарственного растения из сухого измельчённого материала, когда визуальное определение невозможно.

Цель

Проверить подлинность лекарственного растения хвоща полевого в БАД.

Задачи

1. Получить последовательность фрагмента ITS-области из хвоща полевого, входящего в состав БАД.
2. Провести поиск полученной последовательности ДНК в генетической базе данных.
3. Провести сравнительный анализ полученных последовательностей.

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

• Набор реагентов для выделения геномной ДНК из растений от Синтол (EX-513-100)
• Центрифуга для микропробирок
• Термостат
• Микропипетки переменного объёма на 1000, 200 и 20 мкл и наконечники к ним
• Штатив для пробирок, микропробирки объёмом 1,5–2 мл
• Ступка и пестик
• Камера для электрофореза
• Источник напряжения
• Плашка для заливки геля
• Гребёнка
• Микроволновая печь
• Вода, реакционный буфер
• Тaq-полимераза
• ДНК-матрица
• Праймеры
• дНТФ
• Онлайн-информационная база данных NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
• Веб-интерфейс компьютерной программы для множественного выравнивания нуклеотидных и аминокислотных последовательностей Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)

Описание

Хвощ полевой является многолетним растением рода Хвощ семейства Хвощовые (Equisetaceae). Бесплодные весенние побеги используют в качестве лекарственного сырья. В аптеках трава хвоща полевого продаётся в сухом измельчённом виде. Проверить подлинность такой БАД можно при исследовании ДНК растения. Для исследования лекарственных растений на видовом уровне используют область ДНК, примыкающую к 5.8S локусу - ITS2.

Для проведения исследования была выделена геномная ДНК из хвоща полевого. Выделение ДНК осуществлялось с целью получения чистого препарата ДНК, извлечённого из многокомпонентной смеси и состояло из следующих этапов: разрушение клеточных стенок, лизис клеточных мембран, осаждение ДНК, промывка и растворение ДНК.

Для накопления целевого фрагмента ДНК поставили ПЦР с использованием ITS-праймеров. Полученный ПЦР-продукт очистили из реакционной смеси и отдали на секвенирование в ЦКП «Биотехнология» ФГБНУ ВНИИСБ.

С полученной последовательностью провели BLAST-поиск в генетической базе данных NCBI. Полученная последовательность соответствует ДНК хвоща обыкновенного (Equisetum arvense).

Результаты работы/выводы

В своей работе с помощью ДНК-маркеров автор получил нуклеотидную последовательность, которая схожа с последовательностью хвоща полевого на 99,43%, тем самым доказав подлинность БАД хвоща полевого. Данная последовательность также подходит для идентификации вида хвоща полевого.

1. Полученная последовательность схожа с последовательностью хвоща полевого (KX872913.1) на 99,43%. Это говорит о том, что в исследуемой биологически активной добавке действительно находится трава хвоща полевого. Таким образом, подлинность биологически активной добавки хвоща полевого подтверждена.
2. Используемый маркер, основанный на последовательности ITS2, подходит для идентификации лекарственного растения хвоща полевого в препаратах.

Перспективы использования результатов работы

Полученная нуклеотидная последовательность может быть использована для пополнения генетической базы данных, а также при создании ДНК-маркеров для идентификации видов.

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

ФГБНУ ВНИИСБ

Награды/достижения (в каких конкурсах и с какими результатами выставлялась ранее эта работа)

Городской ежегодный конкурс исследовательских работ «Мы и биосфера» – призёр;
Открытая московская инженерная конференция школьников «Потенциал» – участник;
Региональный этап международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения» – участник.