Создание лекарственного средства, не проявляющего гепатотоксичность, на основе парацетамола и глутатиона

Актуальность

Отравления неопиоидными анальгезирующими, жаропонижающими средствами составляют примерно 12% от общего числа острых отравлений лекарственными средствами (МКБ-10: Т39). В частности, выделяют 7 уточняющих диагнозов при отравлении лекарственными средствами: салицилатами (Т39.0), производными 4-аминофенола (Т39.1), производными пиразолона (Т39.2), другими нестероидными средствами (Т39.3), противоревматическими средствами (Т39.4), другими ненаркотическими анальгезирующими и жаропонижающими средствами, не классифицированными в других рубриках (Т39.8), и ненаркотическими анальгезирующими, жаропонижающими и противоревматическими препаратами неуточнёнными (Т39.9). Особую опасность вследствие тяжести течения болезни и других немаловажных факторов собой представляет отравление производными 4-аминофенола, основным представителем которых в современной медицине является парацетамол (пара-ацетиламинофенол). Во время пандемии коронавируса COVID-19 в некоторых медиаресурсах стала появляться информация о том, что при заражении вышеупомянутым вирусом помогают исключительно препараты на основе парацетамола, что по некоторым данным привело к росту числа отравлений лекарственными средствами.

Цель

Проведение модельных реакций окисления парацетамола и его последующей конъюгации с цистеином in vitro.

Задачи

1. Изучение путей метаболизма парацетамола.
2. Изучение свойств глутатиона и цистеина.
3. Получение NAPQI.
4. Конъюгация NAPQI с цистеином.

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

• Делительная воронка
• Штатив
• Плоскодонная колба
• Крепление-кольцо
• Дозатор
• ЯМР-спектрометр
• Лампа ультрафиолетовая
• Аналитические весы
• Испаритель ротационный
• Вакуумный насос
• Мерные цилиндры
• Пинцет
• Ножницы
• Карандаш
• Типсы
• Фен
• Хроматографическая камера
• Фильтр Шотта
• Колба Бунзена
• Делительная воронка
• Мерные колбы
• Водоструйный насос
• Пластинки для тонкослойной хроматографии
• Силикагель (70-230 mesh)
• Пипетки Мора
• Пипетки градуированные
• Магнитная мешалка с подогревом

Описание

Сначала необходимо было провести экстрагирование парацетамола из смеси вспомогательных веществ в лекарственном средстве. Для этого с помощью пестика и ступки нами были измельчены 6 таблеток парацетамола. Порошок пересыпался в делительную воронку, в которую предварительно был налит хлороформ объёмом 30 мл. Также в воронку были налиты 20 мл дистиллированной воды, воронка была плотно закрыта, а содержимое перемешано. Большинство вспомогательных веществ растворились в воде, а сам парацетамол — в хлороформе. Было проведено разделение растворов (поочерёдный слив в разные сосуды). Эти действия были повторены 4 раза для большей чистоты раствора. Нами был получен раствор парацетамола в хлороформе. Было проведено выпаривание хлороформа с помощью ротационного испарителя. В результате чего было получено кристаллическое вещество кремового оттенка.

Для проверки полученного на промежуточной стадии экстракции раствора на чистоту проводился анализ методом тонкослойной хроматографии. В качестве подвижной фазы (системы) была выбрана смесь этилацетата, хлороформа и уксусной кислоты в соотношении 50:50:1 объёмом 10,1 мл. Система была приготовлена с помощью пипетки Мора и дозатора. Была вырезана пластинка с силикагелем размером 1,5 см х 5 см. На неё была нанесена капля анализируемого раствора. Пластинка была помещена в хроматографическую камеру, в которую предварительно были налиты 2 мл раствора (системы). По результатам анализа была рассчитана величина R_f = 0,3 (совпадение со справочными данными о парацетамоле) и, по нашей оценке, анализируемый раствор можно считать достаточно чистым, так как при воздействии ультрафиолетового излучения наблюдалось появление всего одного пятна.

С помощью мерных цилиндров и градуированной пипетки автором была приготовлена система для колоночной хроматографии (этилацетат-хлороформ-уксусная кислота 100:100:2). Затем собиралась установка для флеш-хроматографии, а на дно фильтра Шотта насыпали небольшой слой песка.

Систему для колоночной хроматографии добавили к сухому силикагелю и затем перенесли полученную суспензию в фильтр Шотта. Подключили систему к вакууму (водоструйный насос) и утрамбовали слой силикагеля. Упаренный экстракт растворялся в системе и был нанесён на силикагель.

Добавляя новые порции системы, продолжили элюирование. Фракции собирали объёмом примерно 70 мл. Ход элюирования контролировали методом ТСХ. Опираясь на результаты хроматограммы, собрали 7 фракций, содержащих чистый парацетамол. Фракции объединяли, упаривали и сушили. 

Полученное в результате экстракции вещество в виде кристаллов кремового оттенка было проанализировано методом ЯМР-спектроскопии с помощью лабораторного ЯМР-спектроскопа. По результатам анализа:

         ЯМР 1H δ, м.д. (J, Гц), (DMSO-d6): 1,98 (с, 3H), 6,63-6,71 (м, 2H), 7,30–7,38 (м, 2H), 9,15 (с, 1H), 9,66 (с, 1H).

В ДМСО есть вода, вследствие химического обмена с которой наблюдается заниженная интегральная активность аминогруппы и гидроксильной группы.

Для проведения реакции окисления парацетамола нам необходимо было получить катализатор, а именно – карбонат серебра. Его синтез был проведён с использованием карбоната натрия (m = 2 г) и нитрата серебра (m = 2 г) по схеме:

Na₂CO₃ + AgNO₃ = NaNO₃ + Ag₂CO₃

Для проведения реакции нами была собрана установка, состоящая из штатива, лапки, круглодонной колбы, фильтра, магнитной мешалки и магнитного якоря. При комнатной температуре были взяты парацетамол массой 15 мг и толуол объёмом 2 мл, добавлен катализатор. Выход реакции 100%.

Схема реакции:

Реакцию отфильтровали от карбоната серебра и упарили.

Полученное в результате реакции вещество было проанализировано методом ЯМР-спектроскопии.

Так как в организме глутатион конъюгируется с молекулой NAPQI через тиольную группу цистеина, нами было принято решение провести модельную реакцию именно с цистеином.

Для проведения реакции были взяты NAPQI массой 15 мг и цистеин массой 12 мг. К реакции был добавлен хлороформ объёмом 1,5 мл. Однако конъюгация NAPQI и цистеина не произошла, так как в организме эта реакция проходит в присутствии специальных ферментов.

Дальнейший анализ литературы показал, что реакция конъюгации NAPQI in vivo протекает по типу реакции присоединения Михаэля. Таким образом, нами предлагается схема её возможного протекания in vitro:

Результаты работы/выводы

По итогу проектной работы нами был выделен чистый парацетамол, синтезирован его метаболит NAPQI, то есть созданы условия для его получения in vitro, а также была совершена неудачная попытка конъюгации его с цистеином.

После дальнейшего изучения литературы нами был предложен возможный вариант протекания этой реакции in vitro, но для ее осуществления необходимо провести дополнительный подбор условий реакции.

Перспективы использования результатов работы

Сама идея создания лекарственного средства на основе парацетамола без гепатотоксичных свойств уникальна и в литературе ранее не встречалась, имеются перспективы для дальнейшего развития проектной работы.

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

«МИРЭА» – Российский технологический университет