Влияние концентрации источников углерода и азота в среде на рост бактерии Methylorubrum extorquens

Цель

Изучить влияние концентрации источников углерода и азота в питательной среде на продуктивность Methylorubrum extorquens по биомассе.

Задачи

1.   Подобрать источник углерода для культивирования бактерии Methylorubrum extorquens.

2.   Провести культивирование Methylorubrum extorquens в минеральных питательных средах при различных концентрациях источника углерода и азота.

3.   Выделить и определить содержание биомассы M.extorquens, полученной при культивировании в средах различных составов.

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

• Термошейкер
• Пробирки типа Эппендорф
• Аналитические весы ВЕСЫ ВМ 153м-II
• Автоклав автоматический с вакуумной сушкой STE-8 class B
• Ламинарный шкаф БМБ-II-Ламинар-С 1.2
• Центрифуга UC-1412А

Описание

1.  Культивирование бактерий Methylorubrum extorquens в среде Choi с метанолом, глицерином и ацетатом натрия в качестве углеродных субстратов

Культивирование авторы проводили в питательной среде Choi [8] следующего состава: (NH4)2SO4 0,5 г, KH2PO4 2,14 г, Na2HPO4×12H2O 3,15 г, MgSO4×7H2O

0,45 г, раствор микроэлементов – 2 мл, Н2О – до 1 л. Раствор микроэлементов: CaCl2×2H2O 330 мг, FeSO4×7H2O 130 мг, MnSO4×7H2O 13 мг, ZnSO4×7H2O 13 мг, Na2MoO4×2H2O 4 мг, CuSO4×5H2O 4 мг, CoCl2×6H2O 4 мг, H3BO3 3 мг, Н2О – до 200 мл. В качестве источников углерода использовали метанол, ацетат натрия (водный раствор 0,4 г/мл) и глицерин (водный раствор 0,45 г/мл). Питательную среду и растворы источников углерода (кроме метанола) стерилизовали в автоклаве при 121 °С 20 минут.

В колбы Эрленмейера с 40 мл стерильной питательной среды добавляли 20 мкл метанола, 1 мл раствора ацетата натрия или 1 мл раствора глицерина и по 1 мл 48-часовой культуры Methylorubrum extorquens. Колбы закрывали стерильными целлюлозными пробками и проводили культивирование в термостатируемом шейкере при 28 °С 48 часов. Эксперимент проводили в двух повторах. Стерилизация питательных сред и снесение метанола в среды проводились преподавателем.

Культуры M. extorquens в колбах с питательной средой и разными источниками углерода

2.  Культивирование Methylorubrum extorquens в минеральных питательных средах с метанолом при различных концентрациях источника углерода и азота

Авторы готовили минеральную среду Choi с концентрациями сульфата аммония 0,5, 1,0 и 1,5 г/л и стерилизовали. В стерильный культуральный планшет на 24 лунки добавляли по 1 мл питательной среды и метанол 10 мкл или 5 мкл (1%- и 0,5%-объёмных, соответственно). Схема составления питательных сред на планшете представлена на рисунке 5. Затем во все ячейки добавляли по 50 мкл 48-часовой культуры Methylorubrum extorquens. Культивирование проводили при 28 ºС и 300 об./мин. в течение 48 часов. Стерилизация питательных сред и снесение метанола в среды проводились преподавателем.

3.   Выделение и определение содержания биомассы M.extorquens

Культуры из планшета переносили во взвешенные пробирки типа Эппендорф автоматической пипеткой и центрифугировали при 10000 g 15 минут. Супернатант сливали, содержимое пробирок высушивали при комнатной температуре до постоянной массы, по разнице масс определяли массу бактериальных клеток.

На первом этапе эксперимента проводился подбор источника углерода для культивирования факультативной метилотрофной бактерии Methylorubrum extorquens. Были выбраны следующие источники углерода: метанол, глицерин и ацетат натрия в концентрациях 0,124 моль/л, что соответствовало 0,5%-объёмных метанола, 11,3 г/л глицерина и 10 г/л ацетата натрия. Культивирование проводили в 40 мл жидкой питательной среды в течение 48 часов. Интенсивность роста оценивали визуально. Было обнаружено, что на метаноле бактерии Methylorubrum extorquens растут интенсивнее, чем на глицерине, а в среде с ацетатом натрия рост отсутствовал. В дальнейшем культивирование проводили с использованием метанола как источника углерода в питательной среде.

На втором этапе было проведено культивирование в минеральных питательных средах с метанолом при различных концентрациях источника углерода и азота. Концентрации источника углерода – метанола – составили 0,5- и 1%-объемный, концентрации сульфата аммония, выступающего источником азота, 0,5, 1, 1,5 г/л.

Чтобы определить влияние состава среды на рост M. extorquens, бактериальные клетки выделяли центрифугированием, сушили и определяли их массу.

Результаты работы/выводы

В ходе работы было обнаружено, что на метаноле бактерии Methylorubrum extorquens растут интенсивнее, чем при росте на глицерине и ацетате натрия, поэтому в дальнейшем при работе с данной бактерией

использовали метанол как источник углерода. Также было изучено влияние

концентрации источников углерода и азота в средем на рост бактерии Methylorubrum extorquens. Обнаружено, что наибольшая продуктивность бактерии M.extorquens по биомассе достигалась при 0,5% метанола и 0,5 г/л сульфата аммония. Увеличение концентраций этих компонентов среды снижало интенсивность бактериального роста.

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

Детский технопарк «Альтаир» МИРЭА