Разработка термостабильного состава для ПЦР-наборов

Актуальность

ПЦР используется для проведения научных исследований и клинических диагностических исследований. Но всё же наиболее широко этот метод молекулярной биологии применяется сегодня в медицине в области диагностики наследственных и инфекционных заболеваний.

Цель

Разработать термостабильный состав для ПЦР-наборов.

Задачи

1. На основе литературных данных выбрать оптимальный состав для получения термостабильного состава ПЦР-смеси.
2. На модельном эксперименте с бычьим сывороточным альбумином проверить выбранный состав.
3. Проверить выбранный состав на наборе для ПЦР.

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

• Вортекс до 3000 об/мин, амплитуда 4 мм
• Магнитная мешалка без нагрева, объём по воде 5 л MS-3000
• Автоматические пипетки 2–20 мкл, 20–200 мкл, 100–1000 мкл, Research plus, набор из 3-х, Eppendorf
• Весы аналитические Ohaus AX224
• Спектрофотометр 190–1100нм, однолучевой, СФ-200
• Амплификатор Bio-Rad T-100 Thermal Cycler
• Центрифуга UC-1412А
• Вытяжной шкаф с подводом воды, электрическими розетками и защитным стеклом триплекс ЛАБТЕХ-ШВ-201/202-КГОТ 1200*740*2100
• Мини-камера для горизонтального электрофореза SE-1
• Камера для вертикального электрофореза для Mini-Protean 3 Dodeca Cell
• Источник питания PowerPack Basic
• Автоматические пипетки 100-1000 мкл, 0,5–5 мл, 1–10 мл, Research plus, набор из 3-х, Eppendorf
• Система гель-документирования «Взгляд»
• Центрифуга-вортекс «Фуга/вортекс Комбиспин FVL- 2400N»

Описание

Для приготовления термостабильных составов с модельным белком и составов с ПЦР-смесью навески компонентов растворяли в дистиллированной воде при перемешивании. Затем приготовленные составы с добавлением БСА (состав 1) или ПЦР-смеси (состав 2) раскапывали по эппендорфам по 138 и 56 мкл, соответственно. Половину пробирок каждого состава оставили в жидком виде, другую половину – лиофильно высушили. Затем каждый состав заложили на хранение при 3-х температурных режимах: 10 °С, 25 °С и 40 °С. Стабильность оценивали через 2 недели, 1 и 2 месяца хранения.

Спектрофотометрия образцов модельного состава с БСА

Для подготовки образцов к измерению поглощения в спектрофотометре их растворяли в фосфатном буферном растворе с рН 7,4, доводили объём раствора до 5 мл тем же растворителем. Регистрировали спектры поглощения полученных растворов в диапазоне длин волн 200–400 нм и фиксировали величину поглощения при 278 нм и 350 нм.

Для проведения электрофореза в ПААГ в готовый гель, помещённый в установку и залитый трис-глициновым буферным раствором, наносили подготовленные образцы БСА, оставшиеся после спектрофотометрии. Для этого в микропробирках смешивали по 20 мкл образца с 4 мкл краски для нанесения, перемешивали пипетированием, кратко центрифугировали для сброса капель, оставляли на 5 минут и наносили в карманы геля по 10 мкл. В один из карманов наносили маркер молекулярных весов в объёме 3 мкл. Запускали электрофорез при 30мА на 40 мин. После этого проводили окрашивание геля раствором Кумасси, а затем отмывали не связавшийся с белком краситель с помощью 10%-й уксусной кислоты. Отмытые гели документировали с помощью системы гель-документирования «Взгляд».

Для проведения ПЦР взяли ранее приготовленные смеси для ПЦР, которые хранились в разных условиях (в тепле, холоде и при комнатной температуре) и находились в разном состоянии (твёрдом или жидком). Подписали пробирки и перелили весь объём смеси в пробирки для ПЦР. Также подготовили одну пробирку с положительным контролем и одну пробирку с отрицательным контролем, в которые прилили по 25 мкл свежеприготовленного рабочего раствора для ПЦР. После этого во все пробирки кроме отрицательного контроля добавили контрольную ДНК из набора по 15 мкл и перемешали методом пипетирования. Далее поставили пробирки в амплификатор и запустили ПЦР.

Для подготовки продуктов ПЦР к нанесению на гель к ним добавили буфер для нанесения 4х (по 7 мкл в каждый образец), перемешали пипетированием, сбросили капли на центрифуге и оставили на 5 минут. Приготовили гель для электрофореза. Для этого взяли 0,5 мг агарозы и ТАЕ Буфер 1-кратный – 50 мл. Смешали их и нагрели до полного растворения агарозы в буфере. Остудили гель, добавили в него этидий бромид 2 мкл и снова всё перемешали. Вылили полученный гель на заливочный столик, поставили гребёнку и подождали до его застывания. Переместили гель в камеру для электрофореза и залили буферным раствором так, чтобы он покрывал гель на 1–2 мм. В ячейки, полученные от гребёнки, поместили по 20 мкл ПЦР-продуктов и 3 мкл маркера молекулярных длин ДНК. Запустили электрофорез: 100 Вт 15 минут. Результаты электрофореза ДНК в агарозном геле регистрировали в системе гель-документирования при 365нм: фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся полос.

По полученным данным видно, что с увеличением срока хранения в образцах накапливаются агрегаты (увеличивается поглощение при 350 нм). При этом видно, что лиофилизированные образцы оказались более стабильными относительно друг друга, что связано с отсутствием воды в образцах, особенно при хранении в температурных режимах 10 °С и 37 °С. При хранении состава при комнатной температуре (25 °С) его стабильность сохранялась только в течение 1 месяца, а через 2 месяца хранения наблюдалось резкое увеличение поглощения раствора и при 280 нм, и при 350 нм. Что касается жидкого состава – его поглощение растворов увеличилось уже спустя 2 недели хранения, причём с увеличением температуры хранения наблюдалось увеличение поглощения раствора, что, вероятно, связано с увеличением коэффициента экстинкции при разворачивании белка.

Для дополнительной оценки стабильности составов был проведён электрофорез образцов в полиакриламидном геле спустя 2 месяца хранения. Из электрофореграммы видно, что характерные полосы БСА с молекулярной массой 66 кДа наблюдаются для всех образцов, кроме тех, что хранились при комнатной температуре, что, вероятно, связано с тем, что при хранении в данных условиях выбранный состав не стабилизирует белковую молекулу, и белок разрушается.

Таким образом, по предварительным данным, выбранный состав на основе сахарозы, маннита, ПВП и твина-80 позволяет сохранить белок (БСА) при хранении в лиофилизированном состоянии при 10 °С и 37 °С в течение, как минимум, 2 месяцев, а при хранении в жидком состоянии – при 10 °С – в течение, как минимум, 2 месяцев. Несомненно, для получения более достоверной информации в дальнейшем стоит изучить изменение структуры белка при хранении в разных температурных режимах в данном составе.

Оценку сохранения активности в течение срока хранения Taq-полимеразы в составе ПЦР-смеси готового набора осуществляли путём проведения ПЦР с наработанными составами, хранящимися в разном состоянии (жидкие и лиофилизированные) и при разных температурных режимах 10 °С, 25 °С и 37 °С через 2 месяца хранения. Образцом сравнения служила свежеприготовленная смесь для ПЦР из того же набора.

Результаты работы/выводы

1. На основе литературных данных для получения термостабильного состава ПЦР-смеси выбран состав на основе ПВП, маннита, сахарозы и полисорбата 80.
2. На модельном эксперименте с БСА выявлено, что выбранный состав позволяет стабилизировать белки при хранении в течение 2-х месяцев при 37 °С в виде лиофилизатов, и в меньшей степени – при хранении в жидком виде.
3. Выбранный состав также позволил сохранить стабильность ДНК-полимеразы в ПЦР-смеси «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi s.I.» при хранении в виде лиофилизата в течение 2 месяцев при температуре 37 °С.
4. Таким образом, данная работа показала возможность использования стабилизирующих смесей на основе полиспиртов и дисахаридов для хранения белковых компонентов, в том числе ПЦР-смесей, вне условий холодовой цепи, что может снизить затраты на их транспортировку и хранение и, как следствие, стоимость готового набора и услуги по проведению ПЦР с его использованием.

Перспективы использования результатов работы

В дальнейшем можно изменять концентрацию стабилизирующих компонентов для поиска оптимального стабилизирующего состава, а также перспективным направлением является изучение механизма стабилизации белков данным составом. 

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

Детский технопарк «Альтаир» РТУ МИРЭА