Сфероиды как перспективные модели для тестирования лекарственных препаратов

Актуальность

Разработка новых лекарственных препаратов и их тестирование – очень важный и длительный процесс. От начала выявления рабочих веществ до выдачи регистрационного удостоверения проходит обычно около 15 лет. Однако результаты, полученные при тестировании на монослое клеток, не всегда хорошо коррелируют с результатами клинических исследований, поскольку в 2D-структуре клетки почти не взаимодействуют между собой и с внеклеточным матриксом. В связи с этим всё большее распространение получают 3D-модели. Одной из таких моделей являются сфероиды – шарообразные агрегаты из клеток с максимальной плотностью упаковки. Из-за своей формы они идеально подходят для манипулирования. Сфероиды имеют сложную внутреннюю структуру, отражающую все виды межклеточных контактов, а также взаимодействие клеток с внеклеточным матриксом. Ещё одним важным свойством сфероидов является то, что они могут быть сформированы из разных видов клеток. Всё вышеперечисленное делает их удобной моделью для доклинических исследований лекарственных средств.

Цель

Демонстрация возможности использования сфероидов в качестве трёхмерной модели для тестирования лекарственных препаратов in vitro.

Задачи

1. Фабрикация сфероидов из клеток линий HEK293 и Vero CCL-81 при  различных первоначальных концентрациях клеток: 250, 500, 1000 и 2000 клеток на сфероид.
2. Исследование зависимости диаметров сфероидов от первоначальной концентрации клеток и дня культивирования. Выбор первоначальной концентрации, обеспечивающей максимальную скорость пролиферации клеток в сфероидах.
3. Фабрикация сфероидов с использованием выбранной первоначальной концентрации клеток. Посадка такого же количества клеток для культивирования в монослое. Обработка 1-суточных сфероидов и монослоя клеток противоопухолевыми препаратами цисплатином, докорубицином, фторурацилом и этопозидом на протяжении 72 часов.
4. Оценка жизнеспособности клеток и сфероидов. Оценка количества мёртвых клеток в монослое и в сфероидах. Расчёт значений полумаксимальных ингибирующей (IC50) и цитотоксической (CC50) концентраций и их сравнение для двух клеточных линий и двух способов культивирования.

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

• Планшеты с низкоадгезивным покрытием
• Агарозные формы

Описание

Были сформированы сфероиды из клеток линий Vero CCL-81 и HEK293 при первоначальных концентрациях 250, 500, 1000 и 2000 клеток на сфероид, и изучена кинетика их роста на протяжении 7 дней. Обе клеточные линии через 24 часа образовали сфероиды правильной формы приблизительно одного размера в рамках одной концентрации. Дальнейшее наблюдение показало, что клетки обеих линий сохраняют способность к пролиферации в сфероидах.

Кинетика роста сфероидов, сформированных из Vero CCL-81 (а) и HEK293 (б)

Для изучения влияния противоопухолевых препаратов на пролиферацию клеток Vero CCL-81 и HEK293 в 2D- (монослой) и 3D- (сфероиды) условиях культивирования было использовано три разных метода: с помощью резазурина, с помощью CellTiter-Glo 3D и путём измерения диаметров сфероидов.

Исследовали цитотоксичность 4 противоопухолевых препаратов: цисплатин, доксорубицин, этопозид и фторурацил.

Результаты работы/выводы

1. Сформированы сфероиды из клеток линий Vero CCL-81 и HEK293 и изучена кинетика их роста. На основании полученных зависимостей диаметров сфероидов от первоначальной концентрации клеток подобрана концентрация, обеспечивающая максимальную скорость пролиферации клеток в сфероидах.
2. Проведена оценка антипролиферативной и цитотоксической активности четырёх противоопухолевых препаратов цисплатина, доксорубицина, этопозида и фторурацила на клетках Vero CCL-81 и HEK293 в условиях 2D- и 3D-культивирования.
3. Использовано три метода оценки жизнеспособности клеток. В зависимости от чувствительности методов предложены две схемы эксперимента, основанные на разных способах формирования сфероидов.
4. Показано, что активность противоопухолевых препаратов зависит от способа культивирования клеток и от выбранной для теста клеточной линии.
5. Полученные в работе результаты позволяют рекомендовать сфероиды в качестве трёхмерных моделей для оценки эффективности противоопухолевых препаратов. Предложенные методики формирования и анализа сфероидов могут быть использованы в дальнейшем для планирования экспериментов по тестированию препаратов на сфероидах.