CRISPR/Cas9 для получения гипоаллергенных кошек

Актуальность

Многие содержат или хотели бы содержать дома домашнюю кошку. Однако немалое количество людей испытывают трудности, связанные с развитием аллергии при контакте с кошками, с возникновением сыпей, аллергических ринитов, отёков и прочее. Описаны смертельные случаи после контактов с домашними животными. Имеются данные, что аллергия на кошек или собак может присутствовать у 10–20% населения Земли. Также имеются данные, что в некоторых регионах России до половины всех случаев респираторной аллергии могут быть связаны с эпидермальными антигенами, преимущественно, кошек. Получение гипоаллергенных домашних кошек позволило бы аллергикам содержать их, не опасаясь негативных последствий для здоровья.

Цель

Изучить возможность отредактировать геном домашней кошки (Felis silvestris catus) с помощью направляемых эндонуклеаз таким образом, чтобы прекратить выработку организмом животного аллергенов для человека

Задачи

1. Поиск потенциальных генов – «мишеней», отвечающих за синтез аллергенов (по литературным данным)

2. Выбор наиболее перспективных мишеней с учётом частоты связанных аллергий и возможности воздействия на них

3. Подбор направляющих РНК для системы CRISPR/Cas9, способных направить фермент Cas9 к участкам генов, кодирующих данные гены. 4. Оценка эффективности подобранных sgRNA

5. Культивирование клеток E.coli для трансформации

6. Сборка плазмид, несущих в себе элементы системы CRISPR/Cas9

7. Вставка в плазмидные векторы нуклеотидных последовательностей, относящихся к целевым генам

8. Наращивание плазмид, очистка плазмидной ДНК

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

• Электропоратор MicroPulser
• Набор для выделения плазмидной ДНК ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit
• Автоматические пипетки
• Лабораторная посуда

Описание

Для редактирования были выбраны гены CH1 и CH2, кодирующие белок Fel d1. Сначала автор изучил с помощью базы данных Nucleotide первичную нуклеотидную последовательность целевых генов. Далее с помощью специализированной подпрограммы в составе онлайн-сервиса Benchling подобрал направляющие РНК и оценил их эффективность и специфичность.

Для трансформации была использована линия E. coli Sure2. Плазмиды, содержащие необходимый фермент Cas9, получены с помощью проекта AddGene (#61591 и #71814). Трансформация проводилась методом электропорации или «теплового шока». Целевые плазмиды были выделены и очищены. Корректность расположения вставки в выделенных плазмидах была подтверждена методом секвенирования.

Результаты работы/выводы

В результате автор получил функциональные плазмиды, с помощью которых можно осуществить редактирование выбранных генов с целью получения гипоаллергенных кошек.

Перспективы использования результатов работы

После внесения данных плазмид в клетки эмбриона кошки синтез белков-аллергенов будет подавлен, и мы сможем получить породу гипоаллергенных кошек.

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

ФГБНУ «Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова»