Подбор оптимального состава реакционной смеси для бесклеточного биосинтеза белка

Актуальность

Работа направлена на повышение эффективности синтеза рекомбинантных белков в бесклеточной системе экспрессии. Проведена оптимизация концентрации плазмидной ДНК-матрицы и содержания ионов магния в системе.

Целью работы была оптимизация системы бесклеточной транскрипции и трансляции на модели биосинтеза зелёного флуоресцентного белка (GFP).

Задачи

Определение концентрации и степени очистки матричной плазмидной ДНК методами электрофореза в агарозном геле и УФ-спектрофотометрии.

Оптимизация содержания плазмидной ДНК в реакционной смеси для бесклеточного биосинтеза белка, а также определение оптимальной концентрации ионов магния.

Содержание работы

Реакции синтеза проводили в лунках 96-луночных планшетов при температуре 30 °C. Эффективность биосинтеза белка оценивали путём измерения флуоресценции, а также методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле. Максимальный уровень синтеза GFP наблюдался при концентрации плазмиды 12 нг/мкл и концентрации глутамата магния 10 мкмоль/л.

Выводы

1. Методами электрофореза в агарозном геле и спектрофотометрии определена концентрация плазмидной ДНК в растворе.

2. Раствор плазмиды не содержит примеси РНК и фрагментов хромосомной ДНК.

3. Максимальный уровень синтеза белка наблюдается при концентрации матрицы 12 нг/мкл.

4. Оптимальная концентрация ионов магния в системе составляет 10 мкмоль/л