Регенерация протопластов мутантного растения мха

Актуальность

Регуляторы роста растений являются органическими соединениями, которые стимулируют или тормозят процессы роста и развития растений. Особенно актуально применение регуляторов роста растений в сельском хозяйстве. Главные природные регуляторы роста представлены в растениях фитогормонами. Однако всё больший интерес вызывают пептидные регуляторы роста, которых к настоящему моменту известно не более 10. Одним из таких пептидов является RALF. Актуальностью данного исследования является получение мутантных растений мха по гену RALF с помощью системы КРИСПР/Кас9 редактирования генома и доказательства гомогенности таких растений. Изучение роста и развития полученных мутантов на ранних этапах развития позволит определить роль небольшого пептида у древних растений на примере мха.

Цель

Получить мутантное растение мха и доказать его однородность путём регенерации отдельных клеток и их анализа.

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

• Ламинарный шкаф для стерильной работы

• Центрифуги

• Амплификатор

• Камеры для электрофореза

• Микроскоп Olympus S-40 c фотокамерой

• Микропипетки, пробирки и др. расходные материалы Описание работы

В самом начале исследований автором было выбрано растение мха, которое было получено в результате геномного редактирования RALF-гена. Из этого растения автором была выделена ДНК и определена последовательность нуклеотидов в гене RALF. Анализ последовательности гена позволил найти делецию всего в несколько нуклеотидов. Дальнейшее установление аминокислотной последовательности показало нарушение в образовании нормального пептида. Это доказывает, что исходное растение – мутант.

Поскольку мутантное растение может быть химерным, автором были проверены различные его части на присутствие мутаций. Для этого были получены протопласты и в условиях in vitro регенерированы целые растения. Во всех растениях установлены последовательности гена RALF и во всех была обнаружена мутация.

Во время роста растений-мутантов автором была сделана серия микрофотографий. Проведённый анализ развития растений позволил установить характерные отличия, которые обусловлены мутацией.

Результаты работы/выводы

Показана мутация в гене RALF у растения мха, которое получено в результате геномного редактирования. Из отдельных клеток этого мутанта регенерированы целые растения. Установлено, что все растения-регенеранты имеют те же мутации, что и исходное. Тем самым доказано, что в результате геномного редактирования получают мутанты, которые не являются химерными.

Раннее развитие растений-мутантов по гену RALF показало низкую выживаемость исходных клеток (протопластов) и высокую активность роста.

Перспективы использования результатов работы

Отсутствие химерности получаемых мутантных растений будет использовано в других экспериментах. Это позволит сократить время и процедуры получения мутантных растений. Полученные результаты по изучению раннего развития мутантов обусловливают необходимость проведения дальнейших морфологических опытов.

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

Работа выполнялась в лаборатории функциональной геномики и протеомики растений ИБХ РАН

Мнение автора

«Это был незабываемый опыт работы в институте на профессиональном оборудовании. Мне было очень интересно узнать что-то новое, почувствовать себя настоящим учёным, хотя бы на полгода, которые я работала над своим проектом в ИБХ РАН»