Разнообразие гена LFY и антиоксидантов в культурных видах Brassica

Актуальность

Почти все дачники, выращивающие цветную капусту и брокколи, сталкивались с тем, что их растение зацветает, так как вовремя не собрали урожай. Эту проблему можно исправить, изучая генетическое разнообразие гена LEAFY (сокращенно LFY), что может помочь обнаружить связь определённых нуклеотидов ДНК и таких агрономических важных признаков, как время зацветания. Также все знают о лекарственных свойствах крестоцветных, а именно – о том, что в них содержатся антиоксиданты, очень важные для человеческого организма.

Изучение мутаций важно для селекции растений. Изучение влияния гена LFY на время зацветания может помочь либо ускорить зацветание, либо отсрочить.

Цель

Доказать, что нуклеотидные последовательности гена LFY у капусты кудрявой и репы в малой степени различны.

Задачи

1. Изучить и проанализировать литературные источники и интернет-ресурсы по данной теме; изучить роль гена LFY и антиоксидантов.
2. Выведение гена LFY у репы и капусты кудрявой.
3. Сравнить нуклеотидные и аминокислотные последовательности генов LFY из B. rapa turnip и B. oleracea kale и описать их полиморфизм.
4. Доказать наличие антиоксидантов с помощью химических реакций.
5. Сопоставить полученные результаты с изначальной гипотезой.

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

• Термостат
• Электрофоретическая камера
• Амплификатор
• Центрифуга

Описание

Была изучена информация о растениях (капуста кудрявая и репа) и их полезных свойствах, а также о гене LFY.

Геномную ДНК выделяли из свежесобранных листьев растений Brassica с использованием протокола выделения геномной ДНК из растительного материала с помощью набора готовых реагентов «ДНК-Экстран-3» («Синтол», Россия). Для создания коллекции высококачественной геномной ДНК Brassica, пригодной для долговременного хранения, образцы ДНК были амплифицированы с помощью набора для амплификации целого генома BioRad Е100 Termal Cycler (BioRad Laboratories, США) в соответствии с протоколом производителя.

Для контроля качества ДНК проводили ПЦР с праймерами на ген актина. Электрофорез проводили в 1%-м агарозном геле с маркером молекулярной массы 1 kb GeneRuler (Fermentas, Литва).

Амплификацию фрагментов геномной ДНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводили в амплификаторе BioRad Е100 Termal Cycler (BioRad Laboratories, США).

Для визуализации результатов ПЦР амплификации проводили электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в 2%-м агарозном геле и 1x ТАЕ буфере с добавлением бромистого этидия. Электрофорез проводился в камере для горизонтального электрофореза Hoefer® HE 99 MAX Submarine unit (GE Healthcare, США).

 Результаты электрофореза фиксировали в ультрафиолетовом свете при помощи фотокамеры Biotest и трансиллюминатора Hoefer® MacroVue 20X (GE Healthcare, США) или сканированием геля с помощью Typhoon 9200 Variable Mode Imager (GE Healthcare, США).

Поиск нуклеотидных последовательностей, гомологичных последовательностям-прототипам, был проведён по базам данных NCBI GenBank (подразделы CoreNucleotide, EST, GSS) с использованием алгоритма BLAST 2.2.18. Алгоритм BLAST NCBI был использован с настройками по умолчанию для обеих подпрограмм Megablast (Zhang et al., 2000) и Blastn (Altschul et al., 1997). Определение кодирующей области нуклеотидных последовательностей и границ экзонов и интронов осуществлялось на основании структуры соответствующих элементов у гомологичных генов A. thaliana. Анализ открытой рамки считывания и производной аминокислотной последовательности проводили с помощью интернет-приложения Expasy Translate tool.

Множественные выравнивания последовательностей-прототипов с гомологами, обнаруженными с помощью BLAST, строились с использованием программы Clustal Omega.

Для установления родственных связей между полученной последовательностью белка LFY B. oleracea и другими изученными к настоящему времени последовательностями FRL разных видов семейства Brassicaceae и Arabidopsis thaliana построено филогенетическое дерево. Для построения филогенетического дерева использовали программу MEGA-Х (алгоритм Maximum likelihood).

Для определения наличия антиоксидантов (витамин С) в листьях капусты кудрявой (B. Oleracea kale) и плодах репы (B. rapa) использовали метод окислительно-восстановительного титрования.

Результаты работы/выводы

1. В B. rapa и B. Kale, как и во всех растениях, есть ген LFY, что было экспериментально доказано. 
2. Качественно доказано, что в обоих продуктах питания есть антиоксиданты, но их больше в капусте кудрявой, поэтому она более полезна, чем репа.
3. С помощью лабораторных исследований доказали, что нуклеотидные последовательности гена LFY капусты кудрявой и репы и правда отличаются малым количеством нуклеотидов.

Перспективы использования результатов работы

Продолжение исследования влияния гена LFY на растения.

Награды/достижения

Открытая московская инженерная конференция школьников «Потенциал» – победитель.

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

ФГБНУ ВНИИСБ