Выбор и оптимизация условий ОТ/ПЦР для высокоэффективного анализа уровня экспрессии мРНК гена c-Myc

Актуальность
В последние годы происходит интенсивное накопление информации, необходимой для понимания молекулярных механизмов возникновения и развития раковых заболеваний. Полученные знания способствуют разработке новых классов противоопухолевых агентов, направленных на ингибирование пролиферации клеток. В настоящее время для лечения некоторых типов опухолей успешно используются препараты, направленные на специфическое блокирование функции ряда белков, ответственных за развитие опухолевого процесса. Разработка препаратов, направленных на ингибирование онкогенов семейства Myc, является важным направлением в противоопухолевой терапии. Для этого необходимо иметь высокоточные инструменты, позволяющие отследить уровень экспрессии генов этого семейства. Именно поэтому для проекта была выбрана такая актуальная тема, как «Выбор и оптимизация условий ОТ/ПЦР для высокоэффективного анализа уровня экспрессии мРНК гена c-Myc».

Цель работы: выбор и оптимизация условий ОТ/ПЦР для высокоэффективного анализа уровня экспрессии мРНК гена c-Myc.

Задачи

• Провести анализ теоретических источников, описывающих роль продукта гена c-Myc в регуляции транскрипции (обзор литературы).
• Провести ОТ/ПЦР для гена c-Myc в целях определения уровня экспрессии его мРНК в разных условиях (разное количество циклов).
• Провести электрофорез продуктов ОТ/ПЦР, окрасить и сфотографировать гели после электрофореза.
• Сделать выводы об оптимальных условиях проведения ОТ/ПЦР для гена c-Myc в целях определения уровня экспрессии их мРНК.

Гипотеза исследования
Уровень экспрессии мРНК для гена c-Myc можно эффективно выявлять методом ОТ/ПЦР, при этом существует оптимальное количество циклов.

Содержание работы
Очищенные гуанидинизотиоционатным методом препараты тотальной клеточной РНК были предоставлены лабораторией профессора А.И. Глухова.
Работа с РНК (добавление РНК в смесь ОТ/ПЦР) проводилась под ламинаром, в перчатках и в маске. Оптимизация условий ПЦР проведения ОТ/ПЦР для гена с-Mус в целях определения уровня экспрессии его мРНК включала в себя выбор количества циклов реакций.
Электрофорез специфических продуктов ОТ-ПЦР в 2-процентном агарозном геле, содержащем 5 мкг/мл бромистого этидия. В качестве РНК-матрицы на стадии ОТ использовали 1 мкг тотальной клеточной РНК, полученной из клеточной линии Bro (меланома человека). 

Результаты работы, выводы
По результатам исследования, проведённого в настоящем проекте, были сделаны следующие выводы.

• Оптимизация условий ПЦР проведения ОТ/ПЦР для гена с-Mус в целях определения уровня экспрессии его мРНК включала в себя выбор количества циклов реакций.
• Анализ изображений на компьютере позволил нормализовать уровень экспрессии гена с-Мyc по отношению к уровню экспрессии конститутивного гена β-актина.
• Анализ экспрессии мРНК гена сМУС можно проводить с помощью метода ОТ/ПЦР с высокой эффективностью, при этом можно использовать 1 мкг тотальной клеточной РНК. Более того, было видно, что на геле, кроме специфического продукта ОТ/ПЦР, указывающего на присутствие мРНК сМУС в образце, отсутствуют неспецифические фрагменты ДНК, что говорит о высокой специфичности анализа.
• Можно сделать вывод, что для гена с-Мyc при проведении ОТ/ПЦР оптимальным при выбранных условиях будет 35 циклов.

Таким образом, гипотеза, сформулированная в начале исследования, полностью подтвердилась: уровень экспрессии мРНК для гена c-Myc можно эффективно выявлять методом ОТ/ПЦР, при этом существует оптимальное количество циклов.