Изучение фосфолипидного состава метилотрофных бактерий методом тонкослойной хроматографии

Актуальность

Метилотрофия – возможность организмов использовать органические соединения без C-C связей, таких как метанол, в качестве единственных источников энергии и углерода. Метилотрофы в большинстве своем – строго аэробные бактерии и дрожжи. Использование метилотрофов привлекает внимание исследователей своей перспективностью в биотехнологическом производстве, например, в производстве белков, липидов, гормонов, полисахаридов и т. д. Доступность субстратов метилотрофов образует фундамент для реализации биотехнологического потенциала бактерий. Более того, метилотрофы повсеместно распространены в природе и играют немаловажную роль в круговороте углерода.

Цель

Проведение качественного анализа фосфолипидного состава метилотрофных бактерий

Задачи

1. Проведение литературного обзора
2. Приготовление жидкой питательной среды
3. Посев в жидкую питательную среду
4. Культивирование штаммов прокариот Methylophilus quaylei MT, Methylophilus quaylei SM, Methylobacterium Extorquens LP
5. Получение бактериальной биомассы
6. Экстракция липидов из ранее полученной биомассы
7. Проведение тонкослойной хроматографии с обнаружителями
8. Анализ экспериментальных данных

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

• Шейкер-инкубатор
• Центрифуга
• Вортекс
• Пробирки
• Хроматографические пластинки
• Стеклянная посуда

Описание

Весь эксперимент был разбит на пять последовательных этапов: приготовление питательной среды, культивирование, получение бактериальной биомассы, экстракция липидов и проведение самой тонкослойной хроматографии.

Была использована минеральная питательная среда Choi и формиат натрия как субстрат. После приготовления среда была стерилизована в автоклаве. В колбы Эрленмейера, содержащие 10 мл стерильной питательной среды, вносили культуры бактерий, используя бактериологическую петлю, прокалённую в пламени горелки. Далее непосредственно само культивирование проводили в шейкере.

Следующий этап – выделение биомассы. В качестве метода выделения бактериальной биомассы было выбрано центрифугирование, так как было необходимо максимально освободить культуральную жидкость от содержащихся в ней частиц. Далее для получения липидного экстракта был использован стандартный метод экстракции липидов по Блайю-Дайеру, поскольку он позволяет просто и эффективно выделить липиды из бактериальной биомассы. После добавления системы растворителей хлороформ – этанол – вода к бактериальной биомассе было проведено центрифугирование суспензий с образованием двухфазной системы, в которой нижняя фракция является необходимым липидным экстрактом.

Для проведения качественного анализа был выбран доступный и распространённый метод тонкослойной хроматографии. ТСХ – подвид хроматографии, заключающийся в том, что разделяемые вещества по-разному распределяются между сорбентом и проходящей через него системой растворителей, вследствие чего расстояние, на которое образцы смещаются по слою за один и тот же промежуток времени, различается. Данная разница вызвана разным сродством веществ с системой растворителей и сорбентом.

В работе были использованы хроматографические пластинки Сорбфил, в которых сорбентом является силикагель, и система растворителей хлороформ – этанол – вода в отношении 65:25:4 по объёму. Выбор такой системы растворителей обусловлен тем, что она подходит для изучения полярных липидов: они располагаются в центре пластины с хорошим разрешением, т. е. пятна не перекрываются. В качестве свидетеля был использован фосфатидилхолин яичного желтка. Сразу после высушивания пластинок была отмечена линия фронта и обозначены видимые пятна.

Далее были применены 2 реагента для обнаружения: йод – универсальный обнаружитель, который связывается со всеми липидами, и второй обнаружитель – 5-процентный раствор фосфорномолибденовой кислоты в этаноле, который связывается только с фосфолипидами. В первом случае обработка парами йода проводилась в йодной камере с пожелтением пятен липидов. Во втором случае пластинку опрыскивали раствором кислоты и выдерживали до появления синих пятен фосфолипидов при температуре 100 ⁰С, а для удаления желтой окраски фона пластинки её обрабатывали парами аммиака. Вещества определялись по пройденному расстоянию от линии старта до линии фронта. Это значение постоянно с учётом погрешности в заданной системе растворителей.

После подсчёта значений Rf всех пятен липидов было проведено сопоставление полученных данных с литературным источником. Таким образом удалось идентифицировать фосфолипиды трёх штаммов метилотрофных бактерий.

Результаты работы/выводы

1)   Полученные данные показывают, что основными фосфолипидами двух штаммов M. quaylei являются фосфатидилхолин и диметилфосфатидилэтаноламин.

2)   Основными фосфолипидами M. extorquens являются фосфатидилхолин, диметилфосфатидилэтаноламин и фосфатидилглицерин.

Перспективы использования результатов работы

Полученные данные могут стать основанием для проведения дополнительных исследований.

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

ФГБОУ ВО «МИРЭА – Российский технологический университет»