Генетический анализ активности мобильного генетического элемента на модельном объекте Drosophila melanogaster

Актуальность

Геномы многих эукариот содержат мобильные генетические элементы (МГЭ), способные перемещаться по геному клетки. Работа была посвящена изучению активности МГЭ группы gypsy на модельном объекте Drosophila melanogaster. Эта работа позволяет собственными руками поставить эксперимент методами Томаса Моргана и его учеников, которые создали фундаментальную хромосомную теорию наследования. Благодаря транспозиции МГЭ в локус хромосомы меняется последовательность нуклеотидов в структуре ДНК. Если прыжок происходит в

регуляторный участок ДНК, то процесс синтеза белка может быть нарушен.

Если же МГЭ переместился в ген, то это может привести к полной его инактивации. Изучение строения и функций МГЭ является весьма актуальной задачей для молекулярной генетики, потому что их влияние на наш организм остаётся неизвестным, и данные механизмы могут в дальнейшем использоваться в лабораторных исследованиях для предотвращения различных генных мутаций, вызывающих серьёзные заболевания.

Цель

Проанализировать активность МГЭ gypsy на модельном объекте Drosophila melanogaster.

Задачи

1. Получение гибридов первого поколения (F1) от прямого и обратного скрещиваний линий MS с линией дикого типа CantonS.
2. Анализ линий MS и гибридов F1 от прямого и обратного скрещиваний с помощью ovoD-теста.
3. Расчёт процента транспозиций МГЭ.
4. Получение РНК из мух.
5. Анализ экспрессии.

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

• Стеклянные колбы
• Морилки с диэтиловым эфиром
• Питательная среда для Drosophila melanogaster
• Коммерческий набор ExtractRNA для выделения РНК
• ПЦР-смесь для проведения реакции ПЦР

Описание

Первым этапом работы было получение потомства F1 от прямого и обратного скрещиваний между линиями мух MS и CantonS. При анализе потомства F1 автором было проверено, что ген, связанный с фенотипом «опаленные щетинки», расположен в Х-хромосоме, так как наблюдается единообразие для обратного скрещивания и расщепление на родительские фенотипы для противоположного пола для прямого скрещивания.

На следующем этапе автору было необходимо скрестить виргинных самок F1 от прямого и обратного скрещиваний, а также самок чистых линий MS и CantonS с самцами линии ovoD.

После получения нового потомства были отобраны 25 самок и несколько самцов в индивидуальные пробирки. Через 14 дней автором выполнялась проверка пробирок на наличие личинок. В таблице 1 представлены результаты данного эксперимента.

Линия CantonS является чистой линией дикого типа и не содержит активных копий МГЭ gypsy. Как и следовало ожидать, при скрещивании самок линии CantonS с самцами линии ovoD в новом поколении самок с нормальными яичниками не будет найдено. Это связано с тем, что не происходит «прыжков» МГЭ в ген ovo.

Чистая линия MS содержит в геноме полноразмерную активную копию МГЭ gypsy в гене forked. Линия MS гомозиготна по данной мутации и имеет фенотип «опалённые щетинки». При скрещивании самок линии MS с самцами линии ovoD в следующем поколении были обнаружены самки с функционирующими яичниками, что привело к восстановлению плодовитости. Процент таких особей составил 1,2 %. Из литературных данных известно, что активность МГЭ gypsy 30 лет назад была выше и составляла до 20 % реверсий. Мы показали, что активность упала, но МГЭ продолжает передвигаться по геному.

При скрещивании самок F1 (полученных от прямого и обратного скрещиваний MS и CantonS) с самцами линии ovoD в новом поколении были обнаружены самки с нормальными яичниками. Процент таких особей составил 0,7 %. Данный показатель оказался ниже, чем у чистой линии MS. Это связано с тем, что у линии MS содержится 2 полные активные копии gypsy в гене forked, а гибридов F1 содержится только одна копия.

Стоит обратить внимание, что показатель восстановления плодовитости не отличается для прямого и обратного скрещиваний. Это может указывать на то, что результат воспроизводим, и нет влияния других генетических эффектов на активность МГЭ. Например, мы не наблюдаем материнского эффекта.

Следующим этапом работы был анализ экспрессии МГЭ gypsy методом ПЦР. Данный метод позволяет зафиксировать присутствие РНК исследуемого гена в организме, а также проанализировать его количество в относительных единицах.

После выделения РНК и получения кДНК был поставлен ПЦР в реальном времени. В качестве контрольного известного гена был использован ген β-тубулина. На рисунке 7 представлены результаты относительной экспрессии МГЭ gypsy для самок чистой линии MS и самок F1 (полученных от прямого и обратного скрещиваний MS и CantonS).

РНК МГЭ gypsy присутствует у самок линии MS и самок F1. Относительная экспрессия (относительно известного гена) у линии MS выше, чем у самок F1. Это связано с тем, что у линии MS содержатся 2 полные активные копии gypsy в гене forked, а гибридов F1 содержится только одна копия.

Результаты работы/выводы

1. В результате проделанной работы зафиксировано восстановление фертильности у самок с доминантной мутацией ovoD, что указывает на транспозицию МГЭ в ген ovo.

2. Было показано, что спустя 30 лет после внедрения МГЭ gypsy в геном линии MS, gypsy продолжает передвигаться по геному.

3. Самки от прямого и обратного скрещиваний от линии MS и CantonS демонстрируют единообразие по фенотипу и активности МГЭ gypsy.

4. Процент транспозиций для гибридов первого поколения от прямого и обратного скрещиваний линии MS и CantonS в 1,6 раза меньше, чем у чистой линии MS.

Перспективы использования результатов работы

Способность МГЭ транспозироваться в определённые участки хромосом может в дальнейшем использоваться в лабораторных исследованиях для предотвращения различных генных мутаций, вызывающих серьёзные заболевания.

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

Кафедра генетики биологического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова

Мнение автора

«Выводы, полученные в ходе исследовательской работы, могут помочь в будущем предотвращать заболевания на молекулярно-генетическом уровне благодаря транспозиции МГЭ в мутабильные гены»