Изучение роли гена Brain tumor (brat) в развитии пролиферативных заболеваний головного мозга

Актуальность

В наше время рак занимает 3-е место среди причин смерти человека. Причиной возникновения опухоли чаще всего становится ассиметричное деление клеток. У дрозофил melanogaster ген brain tumor при нарушении в дифференцировке способен вызвать начало ассиметричного деления.

Цель

Выяснить, может ли регуляция со стороны 3-нетранслируемой области влиять на экспрессию белка Brat.

Задачи

1. Сравнить уровень матричной РНК гена Brat в линии мух с предрасположенностью к опухолям (линия cits) c линией дикого типа Oregon R.
2. Скрестить мух линии cits с линией, обладающей повышенной экспрессией гена Orb, способного связываться с 3-нетранслируемой областью и активировать трансляцию белка Brat.
3. Оценить, как изменяется содержание белка в линии мух после скрещивания.

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

Материалы

• Линия мух Oregon R (OR)
• Линия мух с предрасположенностью к образованию опухолей мозга с мутацией по гену Brat (cits)
• Линия Orb, которая обладает повышенной экспрессией гена Or

Оборудование

• Набор фирмы Fermentas (Латвия)
• Амплификатор CFX 96
• Источник питания Bio-Rad

Описание

Для того чтобы объединить в одном генотипе мутации Brat и Orb, авторы отбирали девственных самок линии cits и скрещивали их с самцами линии Orb. Когда в пробирке, в которой происходило скрещивание, появлялись личинки, их собирали иглой и переносили в маленькую пробирку для последующего выделения РНК и белков.

Для выделения РНК был использован набор фирмы Fermentas (Латвия) согласно рекомендациям фирмы-изготовителя. Полученную РНК использовали для получения комплементарной ДНК. ПЦР проводили в амплификаторе CFX 96 (Bio-Rad) с помощью готовой смеси реактивов для ПЦР – мастер микса (производитель СибЭнзим). Для проведения Вестерн-блота (окраски белков на мембране) скальпелем отделяли переднюю часть личинок, растирали в двукратном Laemmli буфере для нанесения, образец прогревали 5 минут при 95 ℃, после чего наносили образец на 8%-ый полиакриамидный гель, проводили электрофорез белков в камере и с использованием источника питания Bio-Rad. Далее определяли наличие белка с помощью проявки мембраны набором Fempto Get, фотографировали полученный результат с помощью трансиллюминатора ChemiDoc.

Вестерн-блот гибридизация с антителами к Brat.

1-лизаты из личинок после скрещивания мух с мутациями Brat и Orb

2 -линия Brat

3-контрольная линия.

 Результаты работы/выводы

1. Мутации в гене Brat не приводят к изменению уровня его мРНК.
2. Трансляционный активатор Orb способен повышать экспрессию белка Brat.
3. Экспрессия белка Brat находится под контролем 3-нетранслируемой области кодирующего его гена Brain tumor.
4. 3-нетранслируемая область гена Brain tumor может быть использована для таргетной терапии опухоли головного мозга.

Перспективы использования результатов работы

Данное исследование может помочь в изучении таргетной терапии.

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

Институт биологии гена РАН

Награды/достижения

Конкурс проектов и исследований «Старт в медицину» 2021 г. – призёр.

Открытая городская научно-практическая конференция «Курчатовский проект – от знаний к практике, от практики к результату» – призёр.

Мнение автора

«Это был интересный опыт, я узнала много нового, научилась работать с серьезным оборудованием. На конференциях была приятная атмосфера, все очень понравилось. Спасибо большое»