Оптимизация метода FISH на бактериях

Актуальность

Флуоресцентная гибридизация in situ, или метод FISH (англ. fluorescence in situ hybridization – FISH), – цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ.

Флуоресцентная in situ гибридизация может применяться в случаях, когда стандартный метод окрашивания по Граму не является информативным.

Грамположительные бактерии имеют очень плотную клеточную стенку, и поэтому ДНК-пробы плохо проникают в бактерию. Было предложено провести флуоресцентную гибридизацию в присутствии фермента лизоцима, который способствует проникновению пробы к ДНК бактерий. Также актуальной и сложной задачей является различение патогенных и непатогенных грамположительных бактерий в бактериальной смеси.

Цель

Провести сравнительный анализ результатов проведения FISH с использованием фермента лизоцима и без него

Задачи

1. Изучить теоретический материал по данной теме
2. Освоить навыки приготовления бактериальных препаратов
3. Поставить эксперимент по оптимизации приготовления препаратов для FISH
4. Провести флуоресцентную in situ гибридизацию с использованием фермента лизоцима
5. Провести идентификацию с помощью FISH бифидобактерий и бацилл

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

• Термошкаф
• Термостолик
• Весы аналитические
• Флуоресцентный микроскоп Zeiss, снабженный цифровой камерой Axio Cam MRm

Описание

Объектами исследования были бифидобактерии и бациллы.

Работа была разделена на три этапа:

1. Опыт заключался в нанесении на одно стекло сразу четырёх капель бактериальной смеси.

Автору удалось без потери качества эксперимента провести FISH, и это не повлияло на качество гибридизации. Все четыре капли были отдельны и не смешивались.

2. Была проведена флуоресцентная гибридизация на бифидобактериях с использованием фермента лизоцима.

Сравнительный анализ флуоресцентной in situ гибридизации показал, что проба лучше гибридизуется при обработке ферментом; на фотографиях видно численное преимущество окрашенных в зеленый цвет гибридизовавшихся ДНК.

3. Идентификация в суспензии бифидобактерий и бацилл с помощью FISH. Для опыта были взяты 2 стекла, нанесена на них смесь бифидобактерий и бацилл. Одно стекло обработали ферментом лизоцимом. Провели стандартную процедуру флуоресцентной in situ гибридизации и с помощью микроскопа визуализировали полученные результаты.

Автору удалось при помощи метода FISH идентифицировать в бактериальной смеси разные виды бактерий, которые нельзя определить стандартными методами (например, по Граму).

Результаты работы/выводы

Полученные результаты говорят о том, что использование фермента лизоцима увеличивает проницаемость клеточной стенки бактерии, что позволяет пробе легче проникнуть к бактериальной ДНК. По фотографиям флуоресцентной in situ гибридизации видно, что проба на препарате с использованием фермента гибридизовалась лучше, чем на препарате без него.

При оптимизации приготовления бактериальных препаратов удалось сократить объём препаратов с четырех до одного, тем самым сократить число стекол.

Метод FISH позволяет идентифицировать грамположительные бактерии, что не удается выполнить с помощью стандартного метода окрашивания по Граму.

Перспективы использования результатов работы

Дальнейшее использования данного метода позволит быстро и точно выявлять в бактериальной смеси патогенные бактерии. Данный метод можно применять при контроле микрофлоры кисломолочных продуктов.

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

ФГБНУ ВНИИСБ, лаборатория прикладной геномики и частной селекции сельскохозяйственных растений

Награды/достижения

Международная научно-практическая конференция «Вавиловские чтения – 2019» – лауреат II степени

Мнение автора

«Этот проект можно использовать для дальнейшего исследования бактерий, что поможет быстро и точно определять состав бактерий в смеси.

На мой взгляд, FISH на бактериях требует дальнейшей оптимизации и усовершенствования.

Данный метод достаточно простой, быстрый в выполнении и точный, что даёт ему преимущество перед другими методами изучения бактерий»