Исследование ингибирующего влияния ряда фосфоротиатных олигонуклеотидов на активность теломеразы в лизатах опухолевых клеток MCF-7 in vitro

Актуальность

Одной из важных задач современной онкологии и фармакологии является разработка соединений, ингибирующих рост опухолей. Несмотря на большое количество проводимых исследований, остаётся открытым вопрос о поиске и применении эффективных противоопухолевых препаратов, способных избирательно воздействовать на раковые клетки и не оказывать негативного действия на организм.

Главными мишенями действия таких лекарственных средств должны являться специфические компоненты раковых клеток, необходимые для их существования и размножения. В нормальных соматических клетках существует механизм контроля пролиферации, обусловленный постепенным укорочением концевых участков хромосом (теломер) в каждом цикле клеточного деления. Раковые клетки обладают способностью обходить этот механизм и тем самым приобретать свойство иммортальности (неограниченного репликативного потенциала.

Цель

Исследование влияния модифицированных олигонуклеотидов, комплементарных матричному участку РНК-компонента теломеразы (TelP5), а также олигонуклеотидов, состоящих из теломерных повторов (TMO24 и TMO12), на теломеразную активность in vitro и оценка их возможного использования в качестве эффективных ингибиторов роста опухолевых клеток.

Гипотеза

Модифицированные фосфоратиатные олигонуклеотиды, комплементарные матричному участку РНК-компонента теломеразы, и модифицированные олигонуклеотиды, имитирующие G-или С-богатую цепь теломерной ДНК, могут выступать в роли специфических ингибиторов теломеразы.

Оснащение и оборудование, использованное при создании работы

• Оснащение и оборудование кафедры биологической химии университета им. И.М. Сеченова

• Готовые лизаты, предоставленные лабораторией куратора проекта

• Центрифуга

• Гель ПААГ

• Высокочувствительный краситель SYBR Gold

• УФ-трансиллюминатор

• Лизирующий буфер CHAPS

• Олигонуклеотидные субстраты

• Пробирки

• Лёд

• Жидкий азот

• Цифровая камера Kodak

• Программа для анализа изображений Image J 1.35I (“National Institute of Health”, США)

Описание работы

Теломеразная активность (ТА) напрямую связана с ростом раковых клеток, которые приобретают иммортальную способность с активацией фермента теломеразы, т. е. способны делиться неограниченно долго.

ПЦР — полимеразная цепная реакция, метод молекулярной биологии, который позволяет добиться увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты в биологическом материале (пробе).

Анализ TRAP — метод, который позволяет определить активность теломеразы в клетках и образцах тканей организма.

Определение ТА в экстрактах из клеток проводили с помощью модифицированного метода TRAP, который основан на ПЦР-амплификации (увеличении, усилении, процессе образования доп. копий участков хромосомной ДНК) продуктов теломеразной реакции, полученных при удлинении ферментом специфического праймера. Элонгацию (биосинтез) олигонуклеотидного субстрата (TS-праймера) и последующую амплификацию проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Трис-HCl (рН 8,8), 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,01% Tween-20, 1,5 мМ MgCl₂, 1 мМ EGTA, 50 мМ каждого dNTP, 0,1 мкг TS-праймера (5’-ATT CCG TCG AGC AGA GTT-3’), 1-10 мкл тканевого экстракта, содержащего 0,7, 2, 4 и 8 мкг белка или 1 мкл (0,7 мкг белка) клеточного экстракта, разбавленного лизирующим буфером CHAPS и эквивалентного 1000 клеткам опухолевой линии.

На стадии ПЦР в реакционную смесь добавляли 0,1 мкг CX-праймера (5’-CCC TTA CCC TTA CCC TTA CCC TAA-3’) и 2,5 ед. акт. SmarTaq ДНК-полимеразы. После стадии элонгации TS-праймера реакционную смесь амплифицировали в течение 35 циклов ПЦР.

Разделение амплификационных продуктов (TRAP-продукты) осуществляли методом электрофореза в 10% неденатурирующем ПААГ, используя 1Tris-боратный-EDTA (TBE) буфер. Образцы после ПЦР вносили в лунки геля в объёме 10 мкл, предварительно смешав их с лидирующим красителем Orange G. Гель окрашивали высокочувствительным красителем SYBR Gold при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин. Визуализацию проводили на УФ-трансиллюминаторе (λ=300 нм). Окрашенные гели фотографировали цифровой камерой Kodak.

Полученные цифровые фотографии оценивали с помощью программы для анализа изображений Image J 1.35I, которая рассчитывает площади пиков (в условных единицах), соответствующих интенсивности свечения в геле дискретных фрагментов TRAP-продуктов. Суммарная площадь пиков принималась за величину ТА в конкретном образце. Далее рассчитывали относительную ТА, сравнивая с положительным контрольным образцом – экстрактом, полученным из клеток теломеразопозитивной опухолевой линии MCF-7 и содержащим 0,7 мкг белка. Теломеразная активность в контрольном образце принималась за единицу (100%).

Исследуемый образец считался теломеразопозитивным при выявлении трёх и более горизонтальных полос TRAP-продуктов, располагающихся на расстоянии друг от друга, отличающемся на длину (6 п. н.) одного теломерного повтора. После полуколичественного анализа ТА в экстрактах, содержащих 8 мкг белка, производили деление пациентов на группы с высокой ТА (при уровне ТА ≥0,4 отн. ед.), средней (0,2–0,39 отн. ед.), низкой (0,1–0,19 отн. ед.) и тех, у кого ТА отсутствует. В качестве отрицательного контроля использовали образец, в который вместо клеточного экстракта вносили чистый лизирующий буфер CHAPS.

В случае исследования ингибирующего эффекта олигонуклеотидов последние вносили в различных концентрациях в реакционную смесь перед стадией теломеразной реакции и перед стадией ПЦР-амплификации, чтобы оценить их влияние не только на теломеразу, но и на Taq-полимеразу. Действие олигонуклеотидов на ТА оценивали путём сравнения результатов анализа электрофореграмм TRAP-продуктов с теломеразопозитивным контрольным образцом, который не содержал олигонуклеотиды.

Разделение амплификационных продуктов осуществляли методом электрофореза в 10% неденатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ), используя 1хTBE (Трис-боратный буфер) буфер (0,089М Трис-борат, 0,089М борная кислота, 0,002М ЭДТА; рН8,0). Образцы после ПЦР вносили в лунки геля в объёме 10 мкл, предварительно смешав их с лидирующим красителем Orange G. Электрофорез проводили в течение 20 мин при напряжённости электрического поля 36 В/см. Визуализацию разделённых TRAP-продуктов проводили на УФ трансиллюминаторе (λ 300 нм) после окрашивания геля в течение 30 мин. в растворе красителя SYBR Gold (разведённого деионизованной водой 1:10000) при комнатной температуре и в темноте.

Результаты работы/выводы

1. Фосфоротиатные олигонуклеотиды практически не ингибировали Taq-полимеразу и не оказывали влияния на стадию амплификации, за исключением TMO24G, внесённого в реакцию в концентрации 60 нМ.

2. Значения IC50 для TelP5 и TMO24G составили 10 нМ, а при концентрациях 40 и 60 нМ наблюдалось практически полное подавление ТА.

3. Фосфоротиоатный олигонуклеотид TMO12G тоже оказывал ингибирующее действие на теломеразу, но его IC50 была выше — 60 нМ, как и для TMO24С.

Таким образом, подтверждена выдвинутая ранее гипотеза, что модифицированные фосфоротиатные олигонуклеотиды, комплементарные матричному участку РНК-компонента теломеразы, и модифицированные олигонуклеотиды, имитирующие G- или C-богатую цепь теломеразной ДНК, могут выступать в роли специфических ингибиторов теломеразы.

Сотрудничество с вузом/учреждением при создании работы

Кафедра биологической химии ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет)

Мнение автора

«Такие конференции, как «Наука для жизни», дают возможность реализовать школьникам свои проекты, сделать первые шаги в науку, благодаря которым желание двигаться дальше и приносить пользу обществу возрастает многократно. Мне очень понравилось участвовать в проекте, который позволил мне окунуться с головой в науку и почувствовать себя приобщённой к настоящему научному процессу. Благодарю всех организаторов проекта, кураторов и руководителей, которые помогли мне в достижении и реализации задуманных задач и целей проекта. Я очень надеюсь, что исследования в этом проекте принесут пользу в получении необходимого лекарства для подавления теломеразной активности в раковых клетках, не причиняя вред всему организму и способствуя быстрому выздоровлению больного»