Введение в культуру in vitro и каллусогенез растений-продуцентов вторичных метаболитов

В настоящее время перед биотехнологией как наукой и отраслью промышленности стоит актуальная задача поиска альтернативных источников и разработки методов получения биологически активных веществ (БАВ) растительного происхождения, применяемых в медицине. На сегодняшний день из растений получают более трети всех лекарственных веществ, используемых в медицинской практике. Структура многих из них настолько сложна, что растения ещё долго будут являться их единственным источником. В связи с этим идёт активный поиск новых альтернативных источников получения БАВ растительного происхождения. Одним из таких источников являются культуры клеток растений, преимущества использования которых заключаются в получении биомассы с заданными характеристиками независимо от сезона, погодных и климатических условий; высокой скорости получения биомассы; отсутствии в биомассе пестицидов, гербицидов, радиоактивных соединений и других поллютантов.

Цель

Введение в культуру in vitro растений Digitalis трёх видов: Digitalis ciliata Trautv., Digitalis grandiflora Lam., Digitalis lanata Ehrh. и анализ состава вторичных метаболитов в полученных культурах.

Задачи

1) Отработать методику проращивания семян в стерильных условиях – стерилизацию семян, подбор оптимальных сред.

2) Получить каллусные культуры клеток d. Lanata, d. Grandiflora, d. Ciliata.

3) Выявить особенности каллусогенеза у digitalis sp. В зависимости от вида растения и органа, из которого был получен эксплант.

4) Проанализировать содержание биологически активных веществ в полученных культурах с помощью тсх у digitalis grandiflora lam.

5) Провести количественный анализ вторичных метаболитов методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.

Содержание работы

В процессе работы над проектом была произведена стерилизация сухих семян. Для этого применили следующие реагенты: детергент (моющее средство) Tween-20 и 50%-й раствор «Белизны» (раствор гипохлорита натрия с содержанием активного хлора 92,5%). Небольшое количество семян (25 штук) поместили в эппендорф, в который затем добавили небольшую каплю детергента и 700 мкл раствора «Белизны». В течение 5 минут семена омывались полученным раствором. Затем удалили этот раствор с помощью автоматической пипетки со стерильным наконечником. Потом производили отмывку семян стерильной дистиллированной водой три раза до состояния чистой прозрачной воды. 

Затем простерилизованные семена переносили на стерильные чашки Петри со средой Мурасиге – Скуга. Причём, половину семян каждого вида посадили на среду с гидролизатом казеина, половину – без него (казеин является источником органического азота), так как в стандартной среде содержится гидролизат казеина, а в литературе имеются данные, что гидролизат казеина может отрицательно влиять на прорастание семян Digitalis. На каждую чашку высаживали 4−9 семян, по 10 чашек для каждого вида. Чашки Петри с семенами находились на стеллажах под люминесцентными лампами дневного света на 16-часовом световом дне. После прорастания семян переносили отобранные, вырезанные скальпелем растительные экспланты (фрагменты тканей или органов растений). Экспланты были двух типов: листовые и гипокотильные. Экспланты переносили на другие стерильные чашки Петри со средой Мурасиге – Скуга, содержащей 2 мг/л альфа-нафтилуксусной кислоты (НУК) − относится к классу ауксинов и 1 мг/л кинетина – относится к классу цитокининов (Smolenskaya et al, 2007), или со средой Мурасиге – Скуга, содержащей 6 мг/л альфа-нафтилуксусной кислоты (НУК) и 3 мг/л кинетина. Также в ходе проекта проводились несколько раз фотосъёмки полученных каллусов с помощью цифровой камеры для микроскопа Levenhuk C800 N6 8M pixels под бинокуляром Микромед MC2 Zoom.

Анализ содержания сердечных гликозидов проводили методом тонкослойной хроматографии.

Удалось прорастить семена всех трёх видов Digitalis в стерильных условиях. Всхожесть семян Digitalis lanata Ehrh. оказалась выше, чем у других видов. Оказалось, что на всхожесть семян Digitalis grandiflora Lam. казеин оказывает отрицательное влияние в условиях проведения данной работы, так как всхожесть становится заметно ниже на среде с казеином, чем на среде без его использования. На всхожесть семян Digitalis ciliata Trautv. и Digitalis lanata Ehrh. в условиях проведения данной работы казеин не влияет: всхожесть остаётся одинаковой как на среде с казеином, так и на среде без использования его.

Перенесённые растительные экспланты в стерильных условиях переходили к процессу дедифференциации, теряли присущую им структурную организацию и специфические функции и начинали делиться, образуя первичный каллус. Также было проведено сравнение каллусов листового и гипокотильного происхождения.

 Выводы

1.      Казеин оказывает отрицательное влияние на всхожесть семян Digitalis grandiflora Lam. На всхожесть семян Digitalis ciliata Trautv.

и Digitalis lanata Ehrh. в условиях проведения данной работы казеин не влияет.

2.      Все три вида Digitalis обладают способностью к каллусообразованию.

3.      Образование различных типов каллусов объясняется видоспецифичностью.

4.      Полученная культура Digitalis grandiflora Lam. обладает способностью к синтезу сердечных гликозидов.

5.      У Digitalis grandiflora Lam. и Digitalis ciliata Trautv. отмечен сходный состав вторичных метаболитов.

6.      В полученных культурах присутствуют фенилэтаноидные и фуростаноловые гликозиды.