Качественный анализ аминокислот методом хроматографии

Актуальность

Изучение аминокислотного состава тканей и биожидкостей человека – одна из главных задач аналитической химии, клинической биохимии, медицины, токсикологии и криминалистики. Нарушение баланса содержания α-аминокислот в тканях, органах и биожидкостях может указывать на возникновение различных патологий.

Цель

Обнаружить аминокислоты методами тонкослойной хроматографии (ТСХ) и круговой бумажной хроматографии (КБХ) и изучить их свойства.

Задачи

1. Изучить с помощью литературных источников различные виды анализа аминокислот и обосновать выбор метода анализа для проведения эксперимента.

2. Подобрать условия для хроматографического разделения аминокислот.

3. Провести разделение смесей аминокислот методами ТСХ и КБХ (идентификацию) и определение степени разделения (Rf) аминокислот.

4. Познакомиться со способами обнаружения аминокислот.

5. Подтвердить методом ТСХ наличие аминокислот в лекарственных препаратах.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Хроматографическая камера

• Фильтровальная бумага

• Капилляры

• Алюминиевая пластинка для ТСХ, покрытая силикагелем

• Пульверизатор

• Лабораторная посуда

• Химические реактивы

Описание

На первом этапе автор проводил разделение смеси аминокислот (валин, изолейцин, лейцин) методом распределительной бумажной хроматографии (КБХ). Для этого приготовили растворы аминокислот с концентрацией 1 мг/мл и смесь органических растворителей, используемых в качестве подвижной фазы в соотношении: бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:1), время насыщения – 1,5 часа. На фильтровальной бумаге наметили карандашом вертикальную линию старта в центре круга радиусом 3–4 см. В центр фильтра капилляром нанесли каплю раствора анализируемого вещества в несколько приёмов, периодически высушивая круглый фильтр. Затем вырезали полоску бумаги длиной до центра окружности, шириной 1,5–2 см и погрузили в растворитель. Круглый фильтр поместили вниз в хроматографическую камеру и опустили полоску для подачи растворителя. Потом аккуратно вынули фильтровальную бумагу из камеры, подсушили круглый фильтр и обработали из пульверизатора 0,2%-ым  раствором нингидрина в ацетоне в камере для распыления.

На втором этапе автор разделил смеси аминокислот методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) и рассчитал величины Rf для аминокислот. Использовали пластинки TLC Silica gel 60 (20×20). Сначала приготовили растворы аминокислот с концентрацией 1 мг/мл и подвижную фазу в соотношениях: бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:1) (если рассчитывать на 24 мл общего объёма: (16:4:4), время насыщения составило 1,5–2 часа. На пластинке для ТСХ провели карандашом линию старта (не нарушая слой сорбента) на расстоянии 1 см от края и нанесли капилляром растворы аминокислот и смесей аминокислот так, чтобы диаметр пятна не превышал 4–5 мм, а центр пятна находился на линии старта. Подсушили пластинку и вновь нанесли анализируемую смесь на линию старта, затем опять подсушили. Пластинку с нанесённой пробой (выше слоя растворителя) поместили вертикально в хроматографическую камеру. Затем пинцетом аккуратно вынули пластинку из камеры (стакана), карандашом отметили линию фронта растворителя, подсушили пластинку над плиткой и обработали из пульверизатора 0,2%-ым раствором нингидрина в ацетоне в камере для распыления. Потом её снова подсушили при +70–80 °C в течение 3–5 мин. Отметили характерную окраску пятен раствором нингидрина. По результатам хроматографического анализа рассчитали величины Rf для аминокислот Rf=l/L.

На третьем этапе автор провёл качественное определение аминокислот в лекарственных препаратах методом ТСХ. Для исследования использовали таблетки препаратов «Глицин», «Глутаминовая кислота» и «Элтацин».

Результаты

1. Методом КБХ смесь аминокислот (валин, изолейцин, лейцин) разделилась недостаточно качественно.

2. Проведена идентификация аминокислот и разделение 3 смесей аминокислот методом ТСХ. Определены степени разделения (Rf) аминокислот. Наибольшей хроматографической подвижностью обладает тирозин, наименьшей глицин. С раствором нингидрина аминокислоты валин, изолейцин и лейцин дают по-разному окрашенные соединения.

3.Качественное определение аминокислот в трёх лекарственных препаратах методом ТСХ показало, что в препаратах «Глицин»  и «Элтацин» присутствует аминокислота глицин, но поскольку в «Элтацин» входят также глутаминовая кислота и вспомогательные вещества, пятно глицина слабее уходит со старта. Глутаминовая кислота присутствует в препаратах «Глутаминовая кислота» и «Элтацин».

Выводы

1. Все аминокислоты обладают разной хроматографической подвижностью, что позволяет провести разделение их смесей.

2. Метод ТСХ имеет по сравнению с другими методами хроматографического анализа ряд преимуществ: экспрессивность, универсальность, наглядность и информативность, простота проведения, что особенно актуально для школьников, которые только начинают знакомство с различными методами анализа биологически важных веществ.

Перспективы использования результатов работы
Метод ТСХ является полуколичественным, поэтому используя данный метод, можно примерно определить массовые доли аминокислот в различных лекарственных препаратах, содержащих аминокислоты. Используя данную работу, можно изучить методы хроматографии на примерах КБХ и ТСХ.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), кафедра аналитической, физической и коллоидной химии.

Награды/достижения

II Городская Сеченовская конференция проектных и исследовательских работ школьников – призёр.

Мнение автора

«Я учусь в медицинском классе и в будущем планирую получить профессию врача, поэтому мне было интересно и важно познакомиться со свойствами аминокислот, методом хроматографического анализа.

Проект «Медицинский класс в московской школе» дал мне базовые знания в области фармации, медицины, что помогло мне при создании исследовательской работы.

Подготовка и участие в конференции «Старт в медицину» стала стимулом для глубокого погружения в тему исследования, дала опыт общения с интересными людьми, позволила почувствовать уверенность в своих силах и представить результаты исследования»