Молекулярная диагностика рака предстательной железы на основе анализа рецепторов фактора роста сосудов

Актуальность 

Рак предстательной железы (РПЖ) является одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин. В настоящее время большое внимание в онкологии уделяется проблеме ангиогенеза – образования новых капиллярных отростков уже существующих крупных сосудов. Кроме того, идёт накопление данных, подтверждающих участие факторов роста в развитии и прогрессировании рака предстательной железы.

"

Повышенная активность белка VEGF (англ. Vascular endothelial growth factor – фактор роста эндотелия сосудов) может привести к возникновению различных болезней. Раковые опухоли не могут вырасти крупнее определённого ограниченного размера, не получив адекватного кровоснабжения. Опухоли, которые способны экспрессировать белок VEGF, могут расти и метастазировать.

Цель 

Провести сравнительный анализ уровней экспрессии генов VEGF и его рецепторов VEGFR-2 / VEGFR-1 методом ОТ/ПЦР в образцах клеточной РНК из биоптатов пациентов с новообразованиями предстательной железы.

Задачи

1. Провести ОТ/ПЦР для двух образцов клеточной РНК (гены VEGF и его рецепторов VEGFR-2 / VEGFR-1).

2. Провести электрофорез продуктов ОТ/ПЦР.

3. Окрасить и сфотографировать гели после электрофореза

4. Обработать изображения продуктов ОТ/ПЦР на геле и сделать выводы об уровне экспрессии генов VEGF и его рецепторов VEGFR-2 / VEGFR-1 у пациентов с новообразованиями предстательной железы.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Лабораторный блок для проведения ПЦР или амплификатор

• Оборудование для электрофореза

• Цифровая камера

• Компьютер

• Агарозный гель

• Флуоресцирующий краситель

Описание

В ходе работы исследовались готовые образцы комплементарной ДНК (кДНК), полученные методом обратной транскрипции (ОТ) из тотальной РНК, выделенной из биоптатов 14 пациентов с новообразованиями предстательной железы. Шесть пациентов имели диагноз «доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ)», а восемь – «рак предстательной железы (РПЖ)».

Образцы кДНК были предоставлены лабораторией кафедры биологической химии Сеченовского Университета.

Образцы ДНК наносили в лунки агарозного геля с последующим проведением электрофореза. Во всех случаях удалось детектировать специфичные продукты.

Анализ экспрессии нормализующего гена бета-актина показал полную идентичность в содержании мРНК в двух исследуемых образцах.

В случае анализа мРНК гена VEGFR-2 получен продукт размером 170 bp, при этом выход ОТ/ПЦР-продукта в одном из образцов выше, чем в другом, что подтверждает его более сильное свечение в геле (рис. А). В случае анализа мРНК гена VEGFR-1 получен продукт размером 324 bp. При этом выход продуктов в двух образцах практически одинаков, что подтверждает отсутствие разницы в их свечении (рис. Б). При анализе мРНК гена hVEGF получены продукты размером 403 bp и 535 bp соответственно. Наличие двух полос на геле показывает присутствие в образцах двух видов мРНК. При этом видно, что в одном из образцов выход специфических продуктов значительно ниже. Это подтверждает заметная разница в свечении этих продуктов в геле (рис. В). При анализе экспрессии гена бета-актина образовывались специфические ПЦР-фрагменты заданного размера (368 bp). При этом видно, что интенсивность свечения ПЦР-продуктов в образцах одинакова, что говорит о том, что в реакцию ОТ/ПЦР было взято эквивалентное количество кДНК-матрицы (рис. Г).

Определение отношения уровней экспрессии hVEGF, VEGFR-2, VEGFR-1 к β-актину позволило понять, при каких исследуемых патологиях и насколько изменяется уровень экспрессии исследуемых факторов относительно стандартного уровня экспрессии конститутивного гена.

В ходе работы определили не только уровень экспрессии отдельных факторов, но и сравнили их между собой, т. к. важным для полноценной передачи сигнала является отношение между уровнями экспрессии лиганда (hVEGF) и рецепторов к нему (VEGFR-2, VEGFR-1).

"

Средний уровень экспрессии гена VEGFR-1 при ДГПЖ ниже в 1,75 раза, чем при РПЖ, а средний уровень экспрессии гена VEGFR-2 при ДГПЖ ниже в 4,4 раза. Следует отметить, что средний уровень экспрессии гена VEGFR-2 при РПЖ превышает средний уровень экспрессии гена VEGFR-1 в 3,96 раза. Средний уровень активности гена hVEGF при злокачественных новообразованиях превышает в 2,4 раза средний уровень активности при доброкачественных новообразованиях. Среднее соотношение уровней экспрессии генов VEGFR-2/hVEGF в 1,6 раза выше при ДГПЖ и в 9,6 раз выше при РПЖ, чем среднее соотношение уровней экспрессии генов VEGFR-1/hVEGF. Среднее соотношение уровней экспрессии генов VEGFR-2/VEGFF-1 при РПЖ в 2,5 раза больше чем при ДГПЖ.

Выводы

1. При измерении уровня экспрессии трёх генов VEGFR-2, VEGFR-1 и hVEGF показано, что активность гена VEGFR-2, отвечающего за пролиферацию эндотелиоцитов, может увеличиваться при злокачественных новообразованиях предстательной железы, тогда как активность гена VEGFR-1, отвечающего за дифференцировку эндотелиоцитов, практически не изменяется при доброкачественных и злокачественных новообразованиях предстательной железы.

2. Уровень активности гена фактора роста эндотелия сосудов (hVEGF) может быть существенно выше при злокачественной патологии, чем при доброкачественных новообразованиях предстательной железы.

Перспективы использования результатов работы 

Отношения уровней экспрессии мРНК VEGFR-1/hVEGF и VEGFR-2/hVEGF могут быть перспективными диагностическими индексами для выявления рака предстательной железы, что позволит более достоверно выявлять злокачественные новообразования предстательной железы по сравнению с диагностическими методами, применяемыми в настоящее время.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И. М. Сеченова Минздрава России.

Награды/достижения

1. Городская Сеченовская конференция проектных и исследовательских работ школьников 2019 г. – победитель.

2. Открытая городская научно-практическая конференция «Инженеры будущего» 2019 г. –призёр.

3. Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Медицинская весна – 2020» – участник.

Мнение автора 

«Я считаю, что моя работа может послужить основой для разработки нового метода диагностирования рака предстательной железы. Благодаря проекту «Медицинский класс в московской школе» я смог принять участие в научно-практической деятельности, чему очень рад. Конференция «Старт в медицину» в этом году была в дистанционном формате, что показалось мне даже более сложным, чем устное выступление перед аудиторией, однако это будет для меня незабываемым опытом»