Определение активности моноклонального антитела 6В11 к рекомбинантному белку вируса гепатита С методом ИФА

Цель

Определение рабочей концентрации моноклонального антитела 6B11 к рекомбинантному белку NS4 вируса гепатита С методом иммуноферментного анализа, при которой комплекс антиген-антитело является наиболее стабильным.

Описание

Вирус гепатита С (ВГС) является одной из наиболее актуальных проблем современности. Это заболевание имеет широкую распространённость: по данным ВОЗ, хронической инфекцией гепатита С страдают около 70 миллионов человек во всём мире, и примерно 399 000 человек ежегодно умирают от этого заболевания.

В связи с этим в мае 2016 года Всемирной ассамблеей здравоохранения разработана стратегия, перспективой которой является ликвидация вирусного гепатита на 90 % и сокращение случаев смерти из-за вирусного гепатита на 65 % к 2030 году.

Актуальность изучения этого заболевания обусловлена:

- высоким риском хронизации инфекции (в 55–85 % случаев острый гепатит С принимает хроническую форму);

- неблагоприятным исходом (у 20–30 % инфицированных лиц гепатит С приводит к циррозу печени или гепатоцеллюлярной карциноме);

- малодоступностью лечения и его высокой стоимостью;

- высокой способностью к изменчивости вируса, затруднённостью симптоматической диагностики (у 80 % людей на начальной стадии заражения не проявляется никаких симптомов, а дальнейшие проявления гепатита С совпадают с проявлениями других заболеваний).

Большую роль в развитии болезни играет вирусный белок NS4, который создаёт мембранную сеть с комплексом репликации РНК-вируса. Таким образом, изучение этого белка играет ключевую роль в лечении гепатита С. Активность белка в клетке можно проследить, пометив его антителом, но для этого необходимо подобрать такое антитело и такую его концентрацию, чтобы комплекс антиген-антитело был наиболее стабильным в среде организма человека.

В работе изучалась способность белка NS4 формировать комплекс антиген-антитело с моноклональным антителом 6В11, что необходимо для изучения механизма функционирования NS4 в культуре клеток гепатокарциномы человека с помощью моноклональных антител.

Задачи

1. Определить эффективность моноклонального антитела 6В11 и возможность его использования в дальнейших исследованиях вирусного белка NS4.

2. Подобрать наиболее эффективную концентрацию моноклонального антитела.

Около 10 лет назад создание вакцины против вируса гепатита С считалось невозможным, так как у вируса было огромное количество штаммов. Однако в настоящее время ведётся активная разработка вакцин против вируса гепатита С, направленных как на профилактику, так и на лечение гепатита С. На данный момент есть несколько направлений, в которых идёт создание вакцины: ДНК-вакцины; пептидные вакцины; вакцины, содержащие ослабленные возбудители; вакцины на основе цельных дрожжей; вакцины на растительной основе и вакцины на основе грибов. В работе подробнее рассказано о ДНК-вакцинах и пептидных вакцинах. ДНК-вакцина против гепатита С основана на активации периферических Т-лимфоцитов, которые способны входить в печень и уничтожать заражённые вирусом клетки. В 2007 году в Уханьском университете (Китай) было создана плазмида, с которой экспрессировалось 6 мутантных рекомбинантных белков E1, которые снижают иммунный ответ хозяина путём блокировки эпитопов Т и В-лимфоцитов. В 2010 году в Швеции была создана вакцина, которая усиливала экспрессию вирусных белков NS3 и NS4A, в ответ на которые в организме заражённого выделяется большое количество Т-лимфоцитов. ДНК-вакцины являются довольно успешными, так как обладают низкой токсичностью. Однако необходима подходящая комбинация действующего вещества и адъюванта, которая может быть определена лишь эмпирически. В настоящее время две ДНК-вакцины (ISCOMATRIX + r*Core and MF59 + r*E1/E2) прошли первый этап лабораторных испытаний. Принцип действия пептидных вакцин также основан на активации Т-клеточного иммунитета путём создания небольших пептидных эпитопов к лимфоцитам организма заражённого из аминокислотных последовательностей вируса. Преимущества таких вакцин – невысокая цена и безопасность производства, а также отсутствие токсинов. Например, в Австрии разработана вакцина «IC41», которая содержит некоторые белки мембраны и группы белков NS3 и NS4. Эта вакцина показала себя достаточно успешной, так как, по данным одного исследования, у 66 % наблюдаемых выявлено статистически значимое снижение вирусной РНК. Однако 2-я фаза клинических испытаний показала увеличение иммунного ответа лишь у 25 % вакцинируемых. Также в фазе первых клинических испытаний находится пептидная вакцина на основе виросом от компании Pevion Biotech Ltd. Оболочка виросомы состоит из фосфолипидов, в которые включены гемагглютинин и нейраминидаза вируса гриппа.

Содержимое виросомы представлено синтетическим фрагментом белков капсида вируса гепатита С.

Исследование и перспектива изучения помеченных МКА 6В11 белков NS4B вируса гепатита С может уточнить роль этого белка в вирусе, так как на данный момент известно лишь то, что он создаёт мембранную сеть, которая помогает репликации, однако более точный механизм пока не открыт.

Были выбраны два варианта разведения МКА – 8 мкг/мл (1:1000) и 10 мкг/мл.

Для работы наиболее подходящим оказался метод непрямого твёрдофазного ИФА, который основан на образовании комплекса антиген-антитело.

Ход работы

1 этап. Сорбция рекомбинантного белка.

Рекомбинантный белок rNS4 засорбировали в разведении 1:2000 по 50 мкл/лунку 96-луночного микропланшета с использованием PBS×1 (однократного соляного буфера).

Инкубация проводилась при +4 °C в течение ночи.

2 этап. Отмывка после сорбции.

Отмывка необходима для удаления несвязавшихся веществ. В каждую лунку многоканальным семплером вносили по 250 мкл PBSTw20 (соляного буфера с содержанием твина-20 в концентрации 0,1 %). Панель отмывали в течение 3 минут, затем содержимое лунок сбрасывали. Отмывку повторяли 4 раза.

3 этап. Титрование и внесение моноклонального антитела 6B11.

4 этап. Инкубация. Проводилась при температуре +37 °C в термостате в течение 1 часа. Планшет закрывался крышкой для предотвращения испарения и кантаминирования.

5 этап. Отмывка. Повторная отмывка для удаления первичных антител, не связавшихся с антигенами. Процесс отмывки производился так же, как на 2 этапе.

6 этап. Внесение конъюгата. В качестве конъюгата использовали вторичные козьи антитела, соединённые с пероксидазой хрена в разведении 1:500 по 50 мкл на лунку с использованием казеина. Инкубация проводилась при температуре +37 °C в термостате в течение 1 часа. Планшет закрывался крышкой.

7 этап. Инкубация в термостате при +37 °C.

8 этап. Отмывка не связавшихся вторичных антител производилась так же, как на 2-м и 5-м этапах.

9 этап. Внесение субстрата.

10 этап. Инкубация при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.

11 этап. Остановка реакции, внесение стоп-реагента по 50 мкл на лунку.

12 этап. Определение результатов на микропланшетном анализаторе.

Для определения рабочей концентрации МКА 6B11 были построены графики с помощью программы Microsoft Excel.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Рекомбинатный белок NS4

• Мышиные моноклональные антитела

• Конъюгат (козьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена)

• Субстрат

• Стоп-реагент

• Казеин для разведения

• PBS×1 (однократный соляной буфер)

• PBSTw20 (соляной буфер с содержанием твина-20 в концентрации 0,1 %)

• Микропланшет

• Многоканальный семплер

• Термостат

• Микропланшетный спектрофотометр (ИФА-ридер)

Результаты

1. Результаты по МКА 6В11 в разведении 8 мкг/мл являются более достоверными, поэтому для дальнейшей работы будет использована концентрация 7,51 мкг/мл моноклонального антитела.

2. В разведении 8 мкг/мл наиболее эффективная концентрация 6В11 меньше, чем в разведении 10 мкг/мл, поэтому использовать концентрацию 7,51 мкг/мл более целесообразно.

3. Доказана эффективность практического применения моноклональных антител на примере МКА 6В11, что обеспечивает возможность его дальнейшего использования в фундаментальных исследованиях, направленных на борьбу с вирусом гепатита С.

Перспективы использования результатов работы

Исследование механизма функционирования rNS4, помеченного моноклональными антителами, в культуре клеток гепатокарциномы человека.
Возможность дальнейшего использования моноклонального антитела МКА 6В11 в фундаментальных исследованиях, направленных на борьбу с вирусом гепатита С.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И. Скрябина.

Особое мнение

«Конференция мне очень понравилась, хороший обмен опытом с ребятами и экспертами в этой области. Хорошо, что проводились мастер-классы, особенно понравилось на кафедре анатомии. Есть предложение по возможности увеличить число мастер-классов по разным темам»