Исследование ингибирующего влияния ряда фосфоротиоатных олигонуклеотидов на активность теломеразы в лизатах опухолевых клеток MCF-7 in vitro

Актуальность

Одной из важных задач современной онкологии и фармакологии является разработка соединений, ингибирующих рост опухолей. Несмотря на большое количество проводимых исследований, остаётся открытым вопрос о поиске и применении эффективных противоопухолевых препаратов, способных избирательно воздействовать на раковые клетки и не оказывать негативного действия на организм.

Цель

Исследовать влияние модифицированных олигонуклеотидов, комплементарных матричному участку РНК-компонента теломеразы (TelP5), а также олигонуклеотидов, состоящих из теломерных повторов (TMO24 и TMO12), на теломеразную активность(ТА) in vitro и оценить их возможное использование в качестве эффективных ингибиторов роста опухолевых клеток.

Задачи

1. Провести анализ ТА методом TRAP с добавлением различных концентраций исследуемых олигонуклеотидов.
2. Провести сравнительный анализ TRAP-продуктов методом электрофореза в полиакриламидном геле.
3. Провести цифровую обработку изображений продуктов в гелях с целью анализа влияния олигонуклеотидов на ТА.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Амплификатор

• Установка для электрофореза нуклеиновых кислот

• УФ-трансиллюминатор

• Цифровая камера Kodak

• Химическая посуда

• Химические реагенты

Описание

Работа проводилась с готовыми лизатами опухолевых клеток MCF-7 (карцинома молочной железы), предоставленными кафедрой биологической химии Сеченовского Университета.
На начальном этапе был проведён сравнительный анализ ингибирования ТА олигонуклеотидами в бесклеточной системе in vitro. Определение ТА в экстрактах из клеток проводили с помощью модифицированного метода TRAP, который основан на ПЦР-амплификации продуктов теломеразной реакции, полученных при удлинении ферментом специфического праймера. Метод состоит из двух этапов: сначала к лизату клеток добавляется олигонуклеотидный субстрат (TS-праймер), который при наличии в лизате активной теломеразы удлиняется за счёт присоединения ферментом теломерных последовательностей к 3’-концу субстрата, затем удлинённый олигонуклеотид амплифицируется методом ПЦР. Элонгацию олигонуклеотидного субстрата (TS-праймера) и последующую амплификацию проводили в 50 мкл реакционной смеси, содержащей буферный раствор, dNTP, TS-праймер и клеточный лизат. При исследовании ингибирующего эффекта модифицированных олигонуклеотидов последние вносили в различных концентрациях в реакционную смесь перед стадией теломеразной реакции и перед стадией ПЦР-амплификации, чтобы оценить их влияние не только на теломеразу, но и на ДНК-полимеразу. На стадии ПЦР в реакционную смесь добавляли CX-праймер и SmarTaq ДНК-полимеразу. Реакционную смесь амплифицировали в течение 35 циклов ПЦР.

Затем провели сравнительный анализ TRAP-продуктов методом электрофореза в полиакриламидном геле. Разделение амплификационных продуктов (TRAP-продукты) осуществляли методом электрофореза в 10%-м неденатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ). Образцы после ПЦР вносили в лунки геля, предварительно смешав их с лидирующим красителем Orange G. Гель окрашивали высокочувствительным красителем SYBR Gold при комнатной температуре в темноте в течение 30 мин. Визуализацию проводили на УФ-трансиллюминаторе (λ=300 нм). Окрашенные гели фотографировали.

Следующим этапом было проведение цифровой обработки изображений продуктов в гелях с целью анализа влияния олигонуклеотидов на ТА. Полученные цифровые фотографии оценивали с помощью специализированной программы для анализа изображений, которая рассчитывает площади пиков (в у. е.), соответствующих интенсивности свечения в геле дискретных фрагментов TRAP-продуктов. Суммарная площадь пиков принималась за величину ТА в конкретном образце. Далее рассчитывали относительную ТА, сравнивая с положительным контрольным образцом – экстрактом, полученным из клеток теломеразопозитивной опухолевой линии MCF-7 и содержащим 0,7 мкг белка. Теломеразная активность в контрольном образце принималась за единицу (100%). Исследуемый образец считался теломеразопозитивным при выявлении трёх и более горизонтальных полос TRAP-продуктов, располагающихся на расстоянии друг от друга, отличающимся на длину (6 п. н.) одного теломерного повтора. В качестве отрицательного контроля использовали образец, в который вместо клеточного экстракта вносили чистый лизирующий буфер CHAPS. Действие олигонуклеотидов на ТА оценивали путём сравнения результатов анализа электрофореграмм TRAP-продуктов с теломеразопозитивным контрольным образцом, который не содержал олигонуклеотиды.

Результаты

1. Результаты исследований, проведённых на клеточной линии MCF-7 (карцинома молочной железы человека), показали, что фосфоротиоатные олигонуклеотиды практически не ингибировали Taq-полимеразу и, следовательно, не оказывали влияния на стадию амплификации, за исключением TMO24G, внесённого в реакцию в концентрации 60 нМ (рис. Б, линия 8).

Ингибирующий эффект фосфоротиоатных олигонуклеотидов TelP5 (А), TMO24G (Б), TMO12G (В) и TMO24C (Г) на активность теломеразы в лизатах опухолевых клеток MCF-7. Линии 1, 3, 5, 7 – добавление олигонуклеотида перед теломеразной реакцией. Линии 2, 4, 6, 8 – добавление олигонуклеотида перед стадией ПЦР-амплификации. Концентрации олигонуклеотида в реакционной смеси – 10 нМ (линии 1, 2), 20 нМ (линии 3, 4), 40 нМ (линии 5, 6), 60 нМ (линии 7, 8). Линия 9 – положительный контроль, линия 10 – отрицательный контроль.

Фотографии TRAP-продуктов в 10% ПААГ, окрашенном SYBR Gold

2. В остальных случаях ингибирующий эффект был обусловлен воздействием на теломеразу. Значения IC₅₀ для TelP5 и TMO24G составили 10 нМ (рис. А и Б, линии 1), а при концентрациях 40 и 60 нМ наблюдалось практически полное подавление ТА (рис. А и Б, линии 5, 7). Фосфоротиоатный олигонуклеотид TMO12G тоже оказывал ингибирующее действие на теломеразу, но его IC₅₀ была выше – 60 нМ (рис. В, линия 7). Аналогичный эффект проявлялся при воздействии на теломеразу TMO24C. Подавление ТА на 50% наблюдалось в концентрации 60 нМ (рис. Г, линия 7).

3. Из полученных данных были рассчитаны коэффициенты специфичности ингибирования для исследуемых фосфоротиоатных олигонуклеотидов.

Ингибирование ТА олигонуклеотидами TelP5 и TMO24G происходит в 6 раз эффективнее по сравнению с действием TMO12G и TMO24C.

Выводы

1. Выбранные автором фосфоротиоатные олигонуклеотиды практически не ингибировали Taq-полимеразу и, следовательно, не оказывали влияния на стадию амплификации за исключением TMO24G, внесённого в реакцию в концентрации 60 нМ.

2. Значения IC₅₀ для TelP5 и TMO24G составили 10 нМ, а при концентрациях 40 и 60 нМ наблюдалось практически полное подавление ТА.

3. Фосфоротиоатный олигонуклеотид TMO12G тоже оказывал ингибирующее действие на теломеразу, но его IC₅₀ была выше – 60 нМ, как и для ТМО24С.

4. Ингибирование ТА олигонуклеотидами TelP5 и TMO24G происходит в 6 раз эффективнее по сравнению с действием TMO12G и TMO24C, из чего можно сделать вывод, что первые обладают более сильным сродством к теломеразе, в частности к hTR, так как их последовательности комплементарны участку hTR, отвечающему за синтез теломерного повтора.

Перспективы использования результатов работы
Олигонуклеотиды, IC₅₀ которых составляет 10 нМ, могут использоваться в качестве специфических ингибиторов опухолевого роста при разработке средств против рака.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), кафедра биологической химии

Мнение автора

«Проект «Медицинский класс в московской школе» позволил мне понять, кем в итоге я всё-таки хотела бы быть, что мне интересно изучать, какую выполнять работу. Проект заинтересовал меня в биохимии, процессах, происходящих на молекулярном и надмолекулярном уровнях, открыл значение знания и понимания химии, позволил понять процесс зарождения такого заболевания, как рак, и найти решения этой непростой проблемы.

Наверное, одним из пожеланий будет привлечение большего количества школьников для участия в таких мероприятиях. Также хотелось бы, чтобы проект «Медицинский класс» появился в школах других регионов»