Шапероны человека в клетках кишечной палочки

Актуальность

Человеческий шаперон HSPB-1 относится к семейству sHsp – малые белки теплового шока. Одной из их основных функций является поддержание функциональной конформации других полипептидных молекул клетки при попадании её в неблагоприятные условия, такие как высокая кислотность, температура, радиация и т. д. В подобной среде нативная конформация белка начинает разрушаться (запускается его денатурация), в то же время шапероны организма мешают процессу денатурации и также сворачивают молекулы обратно в естественную для них структуру. Без белков теплового шока изменение функциональной конформации белковых молекул грозило бы последующей смертью для клеток и, следовательно, для организма. Но помимо исполнения столь важной функции малые белки теплового шока играют роль компонентов других клеточных процессов, например, рефолдинга белков и апоптоза. Мутации данных белков нередко приводят организм человека в состояние инвалидности, а иногда и летальности. Кроме того, экспрессия белков теплового шока необходима для выживания раковых клеток.

Цель

Изучить влияние трансформации бактерии Escherichia coli (кишечная палочка) с помощью вектора с геном человеческого белка HSPB-1 на её термоустойчивость.

Задачи

1. Изучить научную литературу по теме исследования.

2. Трансформировать клетки бактерий Escherichia coli векторами: pET 23b-HSPB1-YFP, pET 23a-YFP, pET 23a(+).

3. Провести трансформированным бактериям тепловой шок (heat shock) при +37 °C (контрольная группа), +42 °C, +60 °C.

4. Подсчитать количество колоний бактерий в чашке каждой из 9 получившихся групп.

5. Сравнить результаты и сделать вывод.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Твёрдотельный термостат «Термит», ДНК-Технология

• Автоматические пипетки Эппендорф и Ленпипет

• Культуральные чашки Петри

• Трансиллюминатор

• Химические реактивы

Описание

Для исследования были взяты 4 микроцентрифужных пробирки типа «эппендорф» с компетентными клетками Escherichia coli штамма Rosetta 2(DE3) physS. Одна группа бактерий была трансформирована «пустым» вектором pET 23a(+). Вторая – вектором pET 23a-YFP (с геном жёлтого флуоресцентного белка). Третья – вектором pET 23b-HSPB1-YFP (с геном химерного белка HSPB1-YFP). Четвёртая группа представляла собой нетрансформированные клетки.

Плазмида pET 23 содержит ген устойчивости к ампициллину, поэтому при высаживании бактерий Escherichia coli в среду данного антибиотика выжили только те клетки, которые были предварительно подвергнуты трансформации. Одни трансформированные бактерии затем подвергались тепловому шоку при +42 °C в течение 20 минут, а другие при +60 °C – в течение 7 минут, контрольная группа при +37 °C – в течение 20 минут.

После завершения теплового шока полученные клетки из девяти эппендорфов высадили на отдельные чашки Петри (20 мл жидкого агара с LB на чашку, 30 мкг/мл – концентрация и ампициллин в концентрации 50 мкг/мл), после чего проводилось наблюдение за ростом колоний бактерий с помощью фотокамеры.

Результаты

После семиминутного пребывания при температуре +60 °C бактерии, трансформированные вектором pET 23b-HSPB1-YFP, показали лучшие результаты выживаемости по сравнению с бактериями, трансформированными векторами pET 23a-YFP и pET 23a(+).

Бактерии, подвергавшиеся тепловому шоку при +42 °C, не показали заметной корреляции между выживаемостью бактериальных клеток и вектором, которыми они были трансформированы. Точно так же после 20 минут, проведённых при температуре +37 °C, все группы бактерий показали одинаково хорошую выживаемость.

Количество колоний E. coli после трансформации и теплового шока

При просвечивании полученных на первом этапе колоний, трансформированных различными векторами, в ультрафиолетовом свете (YFP - λ_ex 514 nm, λ_em 527 nm) клетки, трансформированные векторами, содержащими гены YFP и HSPB1-YFP, светились ярко-жёлтым цветом.

Выводы

1. Трансформация клеток вектором, содержащим человеческий ген HSPB-1, положительно влияет на термоустойчивость бактерий Escherichia coli и приводит к снижению смертности клеток после теплового шока при +60 °C в течение 7 минут.

2. Человеческий белок HSPB-1 может работать в клетках кишечной палочки Escherichia coli.

3. При создании «физиологического теплового шока», то есть инкубации клеток при +42 °C в течение 20 минут, возрастания смертности клеток не наблюдалось.

Перспективы использования результатов работы
Данный эксперимент может стать начальным этапом разработки методов исследования и лечения заболеваний, связанных с недостаточной или излишней активностью белков теплового шока.

Сотрудничество с вузом при создании работы

МГУ имени М. В. Ломоносова, кафедра биохимии биологического факультета