Анализ уровней теломеразной активности методом TRAP и методом TRAP/PCR в реальном времени (RT-TRAP-2PCR)

Актуальность

Проблема поиска новых методов ранней диагностики опухолевых заболеваний является в настоящее время одной из наиболее актуальных в современной онкологии. Возможность выявления опухоли на ранней стадии её развития значительно упрощает последующую терапию заболевания и улучшает прогноз для пациента. Одним из наиболее перспективных универсальных онкомаркеров сегодня является теломераза. Её использование позволяет разрабатывать современные высокочувствительные и высокоспецифичные наборы для диагностики большинства злокачественных новообразований, в том числе на ранних стадиях заболевания. В связи с этим разработка более чувствительных вариантов определения активности теломеразы остаётся крайне актуальной задачей биологии и медицины.

Цель

Повысить эффективность классического TRAP-анализа.

Гипотеза: модификация метода TRAP в реальном времени позволит повысить чувствительность метода анализа активности теломеразы и даст возможность подойти к количественному анализу теломеразной активности.

Задачи

1. Провести ПЦР и классический TRAP-анализ.

2. Провести анализ по модифицированному методу RT-TRAP-2PCR.

3. Сравнить результаты анализов и сделать вывод.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Лабораторный блок для проведения ПЦР

• Установка для электрофореза нуклеиновых кислот

• Система гель-документирования Syngene G:BOX

• Компьютер с ПО GeneTools 4.3.8

• Химическая посуда

• Химические реагенты

Описание

В работе исследовались готовые лизаты, полученные из клеточной опухолевой линии и предоставленные кафедрой биологической химии Сеченовского Университета.
TRAP-анализ проводили в реакционной смеси, содержащей буферный раствор на базе Tris-HCl (pH 8,8), 50 мкМ каждого из четырёх дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTPs), 0,1 мкг TS-праймера, 1–10 мкл клеточного или тканевого экстракта, содержащего 1 мкг белка. Конечный объём реакционной смеси доводили деионизованной водой до 48,5 мкл. В качестве контроля контаминации в реакционную смесь вместо лизата добавляли соответствующее количество CHAPS-буфера.

Реакционную смесь инкубировали при +37 °C в течение 25 минут. После инкубации смесь выдерживали 10 мин. при +96 °C для инактивации теломеразы. Затем добавляли 0,1 мкг CX-праймера и 2,5 ед. SmarTaq ДНК-полимеразы (0,5 мкл). Конечный объём реакционной смеси составил 50 мкл.

Реакционную смесь поместили в термоциклер и провели 35 циклов ПЦР при +94 °C в течение 60 с, +50 °C – 60 с, +72 °C – 90 с. Данная реакция характеризуется как TRAP PCR реакция № 1 (ПЦР № 1). Разделение продуктов реакции осуществляли методом электрофореза в 10%-м неденатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ), используя в качестве электродного буфера 1хTBE. Образцы вносили в лунки геля в объёме 10 мкл, предварительно смешав их с 1,5 мкл буфера для нанесения образцов (раствор красителя Orange G в глицерине). Визуализацию TRAP-продуктов проводили на УФ-трансиллюминаторе (λ = 300 нм) после предварительного окрашивания геля в течение 30 мин. в однократном водном растворе красителя SYBR Gold. При этом результаты анализа оценивались визуально по наличию (положительный) или отсутствию (отрицательный) специфической «лестницы» TRAP-продуктов при электрофорезе.

Метод RT-TRAP-2PCR основан на модификации классического метода определения активности теломеразы методом TRAP. Ключевой особенностью предлагаемого подхода является наличие 2-й последовательной реакции TRAP PCR (реакции № 2) в реальном времени (ПЦР № 2) с другой парой праймеров. На этой стадии ПЦР измеряется суммарное содержание теломерных повторов, новосинтезированных в результате проведения 1-го этапа ПЦР (ПЦР № 1) с праймерами, один из которых представляет собой теломеримитирующий олигонуклеотид, а другой – праймер, комплементарный теломерным повторам в геноме исследуемого биологического объекта в исследуемом образце, т. е., по сути, проводится количественный анализ суммарного содержания всех теломерных повторов (TTAGGG)_n для позвоночных, в том числе для человека. Этот шаг позволяет добиться значительного увеличения чувствительности и специфичности метода.
Инкубационная смесь для проведения ПЦР № 2 содержала буферный раствор на базе Tris-HCl (pH 8,8), 50 мкМ каждого из четырёх дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTPs), по 0,9 мкМ TelG-праймера и TelC-праймера, а также 0,75 x SYBR Green I (краситель), 1 x ROX (референсный краситель), 1 M бетаина, 1,25 ед. SmarTaq ДНК-полимеразы. В подготовленную смесь добавляли 1 мкл реакционной смеси после ПЦР № 1 и проводили 22 цикла ПЦР в реальном времени в следующем режиме: +95 °C – 15 мин; 2 цикла в режиме: +94 °C – 15 с, +49 °C – 15 с; 20 циклов в режиме: +94 °C – 15 с, +62 °C – 10 с, +72 °C – 30 с со снятием сигнала.

Документирование и анализ цифрового изображения. Гели снимали на цифровую фотокамеру в системе гельдокументирования Syngene G:BOX и проводили анализ изображения на компьютере с помощью программного обеспечения GeneTools 4.3.8, которое рассчитывает площади пиков (в условных единицах), соответствующих интенсивности свечения в геле дискретных фрагментов TRAP-продуктов. Суммарная площадь пиков принималась за величину активности теломеразы (АТ) в конкретном образце. Далее рассчитывали относительную АТ, сравнивая с положительным контрольным образцом – экстрактом, полученным из клеток теломеразопозитивной опухолевой линии К562 и содержащим 0,04 мкг белка. АТ в контрольном образце принималась за единицу (100%). 

Результаты

1. Результаты проведённого анализа на примере лизатов клеточной линии К562 (хронический промиелолейкоз человека), содержащих различное количество клеток и эквивалентных различному уровню теломеразной активности (АТ) – от 10 до 80%. Значение порогового цикла (Ct) для положительного контрольного образца, содержащего 100 клеток (все 100% клеток имеют активированную теломеразу), соответствует 4 (Ct=4). При разведении образца значение порогового цикла увеличивается, достигая в образце с низкой теломеразной активностью (10% АТ от К⁺) значения 12 (Ct=12). Наблюдаемый выход флюоресценции в отрицательном контрольном образце К^– – образец, не содержащий клеток (0% теломеразной активности), является результатом неспецифической амплификации дуплекса праймеров TS и CX, которая выражается в появлении кривой с пороговым циклом, равным 19 (Ct=19). Анализ кривых накопления продуктов амплификации теломерных повторов показывает, что значение порогового цикла Ct для 5 исследуемых образцов коррелирует с уровнем активности теломеразы каждого образца. Как видно, значение Ct для К⁺ (100% АТ) составило 4, для высокой АТ (80% АТ от К⁺) – 6, для средней АТ (40% АТ от К⁺) – 9, для низкой АТ (10% АТ от К⁺) – 12 и для К (0% АТ) – 19.

2. Результаты анализа этих же образцов (от 10 до 80%) с использованием классического метода TRAP с электрофоретическим разделением продуктов ПЦР и цифровым анализом изображения в геле (10% электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), окрашенный красителем SYBR Gold, фотография в УФ-свете): 1 – положительный контрольный образец (100 клеток – 100% АТ); 2 – образец с высокой (80% АТ от К⁺); 3 – со средней (40% АТ от К⁺); 4 – с низкой (10% АТ от К⁺) теломеразной активностью; 5 – отрицательный контрольный образец (0% АТ).

Следует отметить, что в образце с низкой теломеразной активностью (10% АТ от К⁺, дорожка 4) классические TRAP-продукты практически не наблюдались, что свидетельствует о недостаточной чувствительности этого метода анализа активности теломеразы.

Выводы

1. Существующие методы определения активности теломеразы считаются недостаточно эффективными, когда анализируется небольшое количество клеточного материала. Это делает невозможным проведение неинвазивного варианта диагностики ряда заболеваний.

2. Модификация TRAP метода до RT-TRAP-2PCR метода значительно повышает чувствительность и точность результатов и даёт возможность подойти к количественному анализу теломеразной активности.

Перспективы использования результатов работы
Внедрение метода RT-TRAP-2PCR может позволить увеличить чувствительность определения активности теломеразы.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), кафедра биологической химии