Моноклональные антитела как современный подход к изучению вируса гепатита C

Актуальность

Вирус гепатита С (ВГС) является одной из наиболее актуальных проблем современности. Это заболевание имеет широкую распространённость: по данным ВОЗ хронической инфекцией гепатита С страдают около 70 миллионов человек во всём мире и примерно 399 000 человек ежегодно умирают от этого заболевания. В связи с этим в 2016 году Всемирной ассамблеей здравоохранения была разработана стратегия, перспективой которой является ликвидация вирусного гепатита на 90 % и сокращение случаев смерти из-за вирусного гепатита на 65 % к 2030 году.

Большую роль в развитии болезни играет вирусный белок NS4, который создаёт комплекс репликации РНК вируса. Именно поэтому, изучение белков ВГС имеет огромное значение для диагностики и лечения гепатита С.

Одним из методов исследования является иммуноферментный анализ (ИФА), ключевыми реагентами которого являются моноклональные антитела (МКА). Моноклональные антитела – это класс антител, которые обладают высокой селективностью в отношении молекулярной мишени (конкретному эпитопу антигена), являющейся, как правило, одним из ключевых компонентов патологического процесса. В основу реакции положено классическое взаимодействие антигена с антителом.

Цель

Изучение свойств МКА 3F11 и 6B11 к рекомбинантному неструктурному белку rNS4 ВГС.

Задачи

1. Определить эффективность работы моноклонального антитела 3F11 (по сравнению с 6B11) методом ИФА.

2. Определить возможность его использования в исследованиях, направленных на изучение рекомбинантного неструктурного белка rNS4 ВГС.                                           

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Рекомбинатный белок NS4

• Мышиные моноклональные антитела

• Конъюгат (козьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена)

• Субстрат

• Стоп-реагент

• Казеин для разведения

• PBS×1 (однократный соляной буфер)

• PBSTw20 (соляной буфер с содержанием твина-20 в концентрации 0,1 %)

• Микропланшет

• Многоканальный семплер

• Термостат

• Микропланшетный спектрофотометр (ИФА-ридер)

Описание

В данном исследовании был использован метод непрямого твёрдофазного ИФА.

Этапы исследования

1. Сорбция рекомбинантного белка

Рекомбинантный белок rNS4 засорбировали в разведении 1:500 и 1:2000 для 3F11 и 1:500 6B11 по 50 мкл в лунку 96-луночного микропланшета с использованием PBS×1 (однократного фосфатно-соляного буфера). Инкубация проводилась при комнатной температуре в течение ночи.

2. Отмывка после сорбции

Отмывка необходима для удаления несвязавшихся компонентов и проводилась путём внесения PBSTw20 (фосфатно-соляного буфера с содержанием твина-20 в концентрации 0,1 %) в объёме 250 мкл в лунку. Панель отмывали вручную в течение 3 мин, затем содержимое лунок сбрасывали. Процедуру повторяли 4 раза.

3. Титрование и внесение моноклональных антител 6B11 и 3F11

Исходная концентрация МКА 3F11 составляла 0,2 мг/мл, МКА 6В11 – 0,3 мг/мл.

Титрование МКА начинали с концентрации 10 мкг/мл и производили шагом 5.

Объём раствора для титрования рассчитывали по формуле С + x = nx, где C – объём в одной лунке, n – фактор разведения, х – искомый объём для титрования.

Таким образом, в первую лунку поместили 50 мкл + 12,5 мкл = 62,5 мкл заранее приготовленного раствора МКА, в остальные лунки добавляли по 50 мкл казеина.

Титрование производили следующим образом: из 1-й лунки с начальной концентрацией МКА отбирали 12,5 мкл раствора, переносили в следующую лунку и перемешивали. Затем, вновь забирали 12,5 мкл и переносили в следующую лунку и так далее. 12,5 мкл, отобранные из последней лунки, сбрасывали.

4. Инкубация

Процесс проводили при температуре +37 °C в термостате в течение 1 часа. Планшет закрывали крышкой для предотвращения испарения и кантаминирования.

5. Повторная отмывка

Необходима для удаления первичных антител.

6. Внесение конъюгата

В качестве конъюгата использовали вторичные козьи антитела, соединённые с пероксидазой хрена в разведении 1:500 по 50 мкл в лунку с использованием казеина.

7. Инкубация

Проводилась при температуре +37 °C в термостате в течение 1 часа. Планшет закрывался крышкой.

8. Отмывка не связавшихся вторичных антител.

9. Внесение субстрата

В каждую лунку вносили по 50 мкл субстрата, который способен связываться с пероксидазой хрена, вследствие чего наблюдалось голубое окрашивание, интенсивность которого зависит от концентрации связавшихся с антигеном первичных антител.

10. Инкубация при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.

11. Внесение стоп-реагента по 50 мкл в лунку.

12. Учёт результатов на микропланшетном анализаторе

После обработки результатов прибор выводил значения оптической плотности раствора в каждой лунке.

Результаты

Для определения рабочей концентрации МКА 6B11 и 3F11 были построены графики с помощью программы Microsoft Excel.

МКА 6В11 в концентрации 10 мкг/мл

МКА 3F11 в концентрации 10 мкг/мл

По оси абсцисс указана концентрация МКА 6В11 и МКА 3F11, которая соответствует фактору разведения 5. По оси ординат – значения ОП.

Линию тренда строили для определения логарифмической функции и величины достоверности аппроксимации.

Чтобы определить х – искомый титр антитела 6В11 и 3F11, считали логарифмическую функцию (ln(x)) по формуле, указанной на графике: вместо «у» подставляли значение ОП 0,1, выражали «х» и умножали его на шаг разведения 5. Такая функция была выбрана потому, что зависимость оптической плотности от концентрации является логарифмической. От полученного числа брали экспоненту и получали искомую концентрацию (титр) моноклонального антитела (данные представлены в таблице 1 и таблице 2 соответственно).

Выводы

1. Результаты по МКА 6В11 в разведении 10 мкг/мл являются более значимыми, чем результаты по МКА 3F11 в том же разведении, т. к. значение 0,97 ошибки аппроксимации ближе к 1, чем значение 0,82. Поэтому эффективней использовать МКА 6B11.

2. Это даёт основание говорить о том, что в лабораторной и клинической практике для обнаружения белка NS4 ВГС в дальнейшем будет применяться моноклональное антитело 6B11.

Перспективы использования результатов работы

Возможность дальнейшего использования моноклонального антитела МКА 6В11 в фундаментальных исследованиях, направленных на борьбу с вирусом гепатита С.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И. Скрябина

Награды/достижения

Открытая городская научно-практическая конференция «Курчатовский проект – от знаний к практике, от практики к результату» – призёр.

XXIX Всероссийская научно-практическая Конкурс-конференция одаренных школьников «Авангард 2020» – диплом 3 степени.

Мнение автора

«Работа помогла на практике познакомиться с методом иммуноферментного анализа, освоить некоторые приёмы и получить навыки лабораторных исследований».