Выбор и оптимизация условий ОТ/ПЦР для высокоэффективного анализа уровня экспрессии мРНК гена C-MYC

Актуальность

Разработка препаратов, направленных на ингибирование онкогенов семейства Myc, является важным направлением в противоопухолевой терапии. Для этого необходимо иметь высокоточные инструменты, позволяющие отследить уровень экспрессии генов этого семейства. Гиперэкспрессия гена C-MYC наблюдается в опухолях миеломы, лимфомы, карциномы и нейробластомы. В силу короткого времени жизни как мРНК, так и белка, довольно важным представляется высокоточное определение уровня экспрессии мРНК гена C-MYC.

Цель

Оптимизировать условия проведения ОТ/ПЦР для определения экспрессии гена C-MYC.

Задачи

1. Получить кДНК из РНК, выделенной из клеточной линии меланомы человека (Bro), с помощью реакции обратной транскрипции.

2. Провести ПЦР на полученной кДНК с праймерами на ген C-MYC при различном количестве циклов.

3. Провести анализ полученных ПЦР-продуктов методом электрофореза в агарозном геле.

4. Сфотографировать гель и провести цифровую обработку полученного изображения.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Амплификатор

• Установка для электрофореза нуклеиновых кислот

• Система гель-документирования Syngene G:BOX

• Компьютер с программным обеспечением GeneTools 4.3.8

• Лабораторная посуда

• Химические реагенты

Описание

Автор провёл ОТ/ПЦР для гена C-MYC с целью определения уровня экспрессии его мРНК в разных условиях. Для этого был использован специальный лабораторный блок, а очищенные гуанидинизотиоционатным методом препараты тотальной клеточной РНК предоставлены Сеченовским Университетом.

Реакцию ПЦР проводили в смеси объёмом 50 мкл, содержащей 67 мМ Tris-HCl (рН 8,8), 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,01% (в/о) Tween 20, 1,5 мМ МgCl₂, 0,2 мМ каждого dNTP, 15 пкмоль каждого из пары праймеров, 2,5 ед. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы, 5 мкл реакционной ОТ-смеси, содержащей кДНК.

Реакция образования первой цепи: комплементарная ДНК (cDNA) образуется на матрице мРНК из dNTP ферментом обратной транскриптазой. Компоненты реакции смешиваются с ДНК-праймером (комплементарным исследуемой мРНК) и буфером с обратной транскриптазой на один час при +37 °C.

Реакция образования второй цепи: после того как обратная транскрипция закончена и образована cDNA на матрице мРНК, следующие циклы производятся по стандартной методике ПЦР.

После проведения 25–35 циклов ПЦР образуются миллионы копий нужной последовательности.

Автор провёл электрофорез продуктов ОТ/ПЦР в 2%-м агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия. В качестве РНК-матрицы на стадии ОТ использовали 1 мкг тотальной клеточной РНК, полученной из клеточной линии Bro (меланома человека). Затем выполнили окрашивание, фотографирование и анализ изображения геля после электрофореза. Гели снимали на цифровую фотокамеру в системе гель-документирование, анализ изображения проводили на компьютере с помощью специализированного программного обеспечения GeneTools 4.3.8.

Уровни экспрессии исследуемых генов нормализовали по отношению к уровню экспрессии конститутивного гена (β-актина), который принимали за единицу.

Работа с РНК (добавление РНК в смесь ОТ/ПЦР) проводилась под ламинаром, в перчатках и в маске.

Результаты

1. Интенсивность свечения окрашенного продукта реакции для гена C-MYC различная в зависимости от количества циклов реакции ОТ/ПЦР. Цифрами над дорожками указано количество циклов ПЦР, стрелкой – положение и размер специфического продукта ОТ/ПЦР.

2. Уровень экспрессии исследуемого гена C-MYC расценивали следующим образом:

- ниже 0,15 отн. ед. – очень низкий;

- от 0,15 до 0,29 отн. ед. – низкий;

- от 0,3 до 0,54 отн. ед. – средний;

- от 0,55 до 0,99 отн. ед. – высокий;

- выше 1 отн. ед. – очень высокий (гиперэкспрессия).

Выводы

1. Анализ экспрессии мРНК гена C-MYC можно проводить с помощью метода ОТ/ПЦР с высокой эффективностью, используя при этом 1 мкг тотальной клеточной РНК. Более того, кроме специфического продукта ОТ/ПЦР, указывающего на присутствие мРНК C-MYC в образце, отсутствуют неспецифические фрагменты ДНК, что говорит о высокой специфичности анализа.

2. Для гена C-MYC при проведении ОТ/ПЦР оптимальным при выбранных условиях будет 35 циклов, т. к. в этом случае накапливается наибольшее количество продуктов.

3. Анализ изображений на компьютере с помощью программы GeneTools v.4.3.8. позволил нормализовать уровень экспрессии гена C-MYC по отношению к уровню экспрессии конститутивного гена β-актина.

4. Для подтверждения полученных результатов разработанную тест-систему необходимо проверить на большем количестве образцов.

Перспективы использования результатов работы
Разработанную тест-систему можно использовать для оценки уровня экспрессии онкогенов семейства Myc.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет)

Мнение автора

«Конференция «Старт в медицину» дала мне возможность познакомиться с научной медициной. Работа над проектом была сложная, но результаты этого стоили. Было интересно работать с такой важной и очень интересной темой»