Исследование взаимодействия ДНК-аптамерных ингибиторов с тромбином

Цель

Сравнение действия ДНК-аптамерных ингибиторов по отношению к тромбину и выявление наилучшей модификации, влияющей на специфичность связывания с тромбином.

Описание

При операциях и при переливании крови, а также для хранения крови в лабораториях и больницах необходимо предотвратить процесс свёртывания крови. Для хранения можно применять низкомолекулярные соединения, например, гепарин и органические кислоты, которые вне организма человека будут предотвращать процесс коагуляции. Большие концентрации низкомолекулярных соединений у человека вызывают побочные эффекты и плохо выводятся из организма. Поэтому необходимо найти ингибитор, который в небольших концентрациях будет специфически подавлять активность каскада коагуляции. G-квадруплекс – это неканоническая структура ДНК, образованная связями между четырьмя гуанинами.

В начале 1990-х годов учёные открыли семейство одноцепочечных аптамеров ДНК, связывающих тромбин. Наиболее мощными из них являются G-квадруплексы. Кроме того, было установлено, что этот аптамер может ингибировать как свободный, так и связанный тромбин, и может продлить время свёртывания крови в несколько раз в чистом фибриногене и в плазменных анализах.

ДНК-аптамерные ингибиторы, препятствующие свёртыванию крови, могут стать более эффективным лекарством, чем существующие аналоги, так как они обладают рядом преимуществ:

1) их легко получить химическим синтезом в нужных для терапевтического применения количествах;

2) они не вызывают иммунного ответа;

3) для них можно подобрать антидот (комплементарный олигонуклеотид), что почти исключает опасность передозировки;

4) их высокая растворимость обеспечивает возможность осуществления внутримышечных и подкожных инъекций.

Задачи

1. Изучить доступную литературу по теме.

2. Ознакомиться с принципом работы спектрофотометра Tecan.

3. Определить зависимость параметров от концентрации ДНК-аптамерных ингибиторов.

4. Выявить наилучшую модификацию, влияющую на специфичность связывания с тромбином.

В работе была проверена эффективность ингибитора тромбина, ДНК-аптамеров Nu-172, 15-TBA, RA-36, 31-TBA в качестве ингибитора генерации тромбина. Образование тромбина оценивалось в тесте генерации тромбина, суть которого заключается в определении концентрации фермента по гидролизу его флуорогенного субстрата. Аналитическим сигналом в исследовании является интенсивность флуоресценции, регистрируемая с помощью микропланшетного ридера Tecan SPARK 10M.

Перед проведением эксперимента с помощью калибровочного набора от производителя была построена градуировочная зависимость, связывающая интенсивность флуоресценции с концентрацией тромбина, что позволило определить концентрации тромбина в режиме реального времени. Данные с прибора поступают на компьютер в соответствующую программу, которая выдаёт первичные кривые генерации тромбина. Эти кривые показывают зависимость флуоресценции от времени. Возникает свечение, так как образующийся в каскаде тромбин расщепляет флуорогенный субстрат с образованием флуорофора, который излучает свет. Эти кривые преобразуются в кривые генерации тромбина с помощью дифференцирования.

Кривые генерации характеризуются тремя параметрами:

1) Лаговое время или время задержки каскада – время, когда тромбин не образуется.

2) Пиковое время – время максимальной концентрации тромбина.

3) Эндогенный потенциал (площадь под кривой генерации) – количество образовавшегося тромбина.

Для сравнения ингибиторов вместо 25 мкл дистиллированной воды добавляют растворённый в воде аптамер в разных концентрациях. Получаются кривые генерации тромбина, отличающиеся от первоначальных, затем характеризуют их по трём вышеописанным параметрам.

План эксперимента:

1. Ознакомиться с прибором спектрофотометр Tecan.

2. Провести эксперимент без аптамерных ингибиторов.

3. Провести эксперимент в тех же условиях, но с присутствием в реакциях ингибиторов

в разной концентрации.

4. Сравнить параметры (лаговое время, пиковое время и эндогенный потенциал)

для разной концентрации ингибиторов при связывании с тромбином.

5. Сделать вывод о специфичности связывания.

Оснащение и оборудование, использованное в работе:

• реагенты in vitro для исследования гемостаза;

• флуорогенный субстрат;

• дистиллированная вода microQ;

• аптамеры ДНК;

• раствор KCl;

• спектрофотометр Tecan 96-луночный;

• пипетаторы.

Результаты

Были получены и количественно проанализированы профили генерации тромбина в присутствии четырёх G-квадруплексных ДНК-аптамеров к тромбину, на основании которых можно утверждать, следующее:

ДНК-аптамерные ингибиторы замедляют время появления тромбина в каскаде.

ДНК-аптамерные ингибиторы снижают его суммарное количество при коагуляционном ответе.

Ряд антикоагуляционной активности выглядит следующим образом: модифицированный минимальный фармакофор (31-TBA)< удвоенный фармакофор (RA-36) минимальный фармакофор (15-TBA) < фармакофор с дуплексным модулем (Nu-172).

Наиболее явно от концентрации зависит время для Nu-172, т. е. при наименьших концентрациях наблюдается наибольшая задержка каскада.

Следовательно, более эффективно с тромбином взаимодействует ингибитор Nu-172, что представляет перспективу для выведения его на рынок.

Перспективы использования результатов работы

В настоящее время аптамерные молекулы на основе ДНК активно исследуются по способности взаимодействовать с различными белками. В первую очередь, это актуально для клинической медицины. ДНК-аптамерные ингибиторы, препятствующие свёртыванию крови, могут стать более эффективным лекарством, чем существующие химические аналоги.

Сотрудничество с вузами при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России, кафедра химии. МГУ имени М.В. Ломоносова, кафедра биохимии.

Награды/достижения

Городская Сеченовская конференция проектных и исследовательских работ школьников – победитель.

Особое мнение

«Медицинский класс в московской школе» – это замечательный проект. Он даёт возможность получить глубокие знания по химии и биологии и реально подготовиться к поступлению в медицинские вузы и в вузы химико-биологического направления. Очень важно, что в этих классах проводится систематическая серьёзная предпрофессиональная подготовка, позволяющая сориентироваться в профессии и выбрать именно своё направление.

Обучаясь в медицинском классе, я впервые попробовала себя в качестве исследователя, сделала свой первый научно-исследовательский проект и поняла, что это моё. Я увлеклась биохимией и уверена, что моя профессия будет связана с научно-исследовательской работой»