Изучение гена FRIGIDA-LIKE в видах Brassica

Актуальность

Сроки цветения растений регулируются сложным генетическим механизмом. Изучение таких генов может быть полезным при создании новых инструментов для селекции культурных растений на раннеспелость и продолжительность вегетационного периода. FRIGIDA-LIKE

Цель

Изучить разнообразие гена FRIGIDA-LIKE у культурных видов рода Brassica (Капуста).

Задачи

1. Найти и подобрать праймеры для амплификации гена FRIGIDA-LIKE из культурных растений рода Brassica.

2. Амплифицировать ген методом ПЦР из культурных растений рода Brassica.

3. Найти в базе данных похожие последовательности FRIGIDA-LIKE.

4. Провести сравнительный анализ этих последовательностей.

5. Доказать наличие антиоксидантов с помощью химических реакций.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Праймеры FRL F и FRL R
• Электронный микроскоп
• Амплификатор
• Аппарат для электрофореза
• Твёрдотельный термостат
• Центрифуга
• Набор готовых реагентов «ДНК-Экстран-3» («Синтол», Россия)
• Химическая посуда

Описание

В работе использовали культурные растения из рода Brassica.

С помощью BLAST поиска в генетической базе NCBI автором было найдено несколько последовательностей гена FRIGIDA-LIKE. В качестве матрицы для поиска брали нуклеотидную последовательность гена прототипа FRL Arabidopsis Thaliana.(BK004884.1).

Праймеры были подобраны для амплификации фрагмента гена FRL, который соответствует области белка, осуществляющего физическое взаимодействие с белком FRIGIDA. Подбор праймеров осуществляли относительно FRL B.oleracea (XM_013743365).

Далее автор получил геномную ДНК для проведения амплификации гена LFY из культурных видов Brassica. Для этого выделили ДНК из капусты кочанной и листовой и проверили ранее выделенные в лаборатории образцы геномной ДНК на пригодность к проведению ПЦР. Выделение геномной ДНК из растительной ткани проводили с использованием набора готовых реагентов «ДНК-Экстран-3» («Синтол», Россия) по протоколу фирмы-производителя.

Для проверки качества выделенной ДНК провели электрофорез ДНК в агарозном геле. Основные критерии для определения качества ДНК: она должна быть хорошо видна на геле, минимальная концентрация образца приблизительно 30 нг/мкл, на дорожках электрофореза не должно быть «шмеров», т. е. ДНК должна быть чистой.

Для проведения ПЦР было выбрано четыре образца ДНК (B. oleracea к-247, B. rapa к-156, B. oleracea А120Н, Raphanus sativus 6800) и использованы праймеры PAW S6. По результатам ПЦР с этими праймерами на электрофорезе получились спектры. Такие спектры индивидуальны для каждого образца, что позволяет отличать одно растение от другого на молекулярно-генетическом уровне. Для визуализации полученных спектров ДНК использовали электрофорез в 2%-м агарозном геле.
Амплификацию гена FRL из Brassica проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Затем автором была проведена и отдана на секвенирование экстракция ДНК из реакционных смесей, после чего был проведён анализ последовательностей.
В конце работы выполнены качественные реакции на наличие антиоксидантов в изучаемых растениях.

Результаты

1. Подобрана система праймеров для амплификации целевого гена.

2. Найдены гомологичные последовательности гена FRL с помощью BLAST-поиска в генетической базе данных NCBI.

3. Самыми пригодными для работы оказались образцы B. rapa к-507, B. oleracea к-2570, B. oleracea к-247 и B. oleracea к-950. У образца B. rapa к-156 небольшая концентрация ДНК (около 20 нг/мкл), поэтому для проведения ПЦР на реакцию желательно брать минимум 2 мкл матрицы.

Результат электрофореза полученной геномной ДНК культурных видов Brassica

М – маркер молекулярного веса GenRuller 1kb Plus («Fermentas»), 1 – B. rapa к-507 , 2 – B. oleracea к-2570, 3 – B. rapa к-156, 4 – B. oleracea к-247, 5 – B. oleracea к-950

4. В результате ПЦР с праймерами были получены индивидуальные для каждого проанализированного образца спектры ДНК – генетический профиль. Спектры получились чёткие и ровные. По ДНК-профилям видно, что спектры различные и наглядно иллюстрируют различия геномов.

ДНК-профили культурных видов семейства Brassicaceae

М – маркер молекулярного веса GenRuller 1kb Plus («Fermentas»), 1 – B. oleracea к-247, 2 – B. rapa к-156, 3 – B. oleracea А120Н, 4 – Raphanus sativus 6800.

5. В капусте кудрявой (Brassica oleracea kale) больше антиоксидантов, чем в репе (Brassica rapa turnip).

Выводы

1. По химическому составу капуста кудрявая и репа являются кладезем ценных микроэлементов, которые можно использовать в лечебных целях или как сырьё в фармакологии.

2. У капусты и репы ранний переход к цветению приводит к потере урожая, поэтому сдвиг сроков цветения является важной задачей.

3. Ген FRIGIDA-LIKE является одним из активаторов экспрессии FLOWERING LOCUS C, который, в свою очередь, отвечает за подавление цветения путём репрессии генов.

4. Ген FRIGIDA-LIKE стабилизирует комплекс FRI-C, необходимый для активации транскрипции FLOWERING LOCUS C.

5. Гипотеза о том, что гены FRIGIDA-LIKE в капусте кудрявой (Brassica oleracea kale) и репе (Brassica rapa turnip) отличаются последовательностью, пока не подтверждена, т. к. работа будет иметь продолжение.

Перспективы использования результатов работы

Исследование может быть полезно и интересно учащимся, увлекающимся селекцией, биотехнологией или генной инженерией.

Сотрудничество с учреждением при создании работы

ФГБНУ ВНИИСБ

Мнение автора

«Я благодарна конференции «Старт в медицину» за предоставленную возможность участия и полученный незабываемый опыт»