Выявление генетического материала Mycobacterium leprae с помощью различных тест-систем методом ПЦР в реальном времени

Цель

Провести сравнение эффективности однокопийных и мультикопийных маркеров генома Mycobacterium leprae, используемых для идентификации присутствия патогена в организме человека, методом ПЦР в реальном времени.

Описание

Метод диагностики лепры, основанный на использовании ПЦР в реальном времени, позволяет выявлять наличие ДНК-патогена на ранних стадиях заболевания, что увеличивает эффективность терапии и предотвращает тяжёлые последствия для пациентов.

Задачи

1. Изучение основных правил проведения работ в клинико-диагностической лаборатории, в том числе работе с патогенами.

2. Освоение лабораторного метода ПЦР в реальном времени.

3. Выделение ДНК из клинических образцов скарификатов кожи пациентов, характеристика препаратов ДНК.

4. Анализ присутствия Mycobacterium leprae в клинических образцах с помощью диагностических наборов, использующих амплификацию участков: RLEP (повторяющийся элемент генома лепры), гена sodA (кодирует фермент супероксиддисмутазу), гена rpoB (кодирует β-субъединицу бактериальной РНК-полимеразы), гена mntH (кодирует марганцевый транспортёр).

5. Оценка эффективности амплификации различных участков генома Mycobacterium leprae методом ПЦР в реальном времени.

Лепра – хроническая инфекционная болезнь с продолжительным инкубационным периодом, вызываемая патогенной кислотоустойчивой бактерией Mycobacterium leprae. Базовым лабораторным методом диагностики лепры является обнаружение в препаратах Mycobacterium leprae при помощи световой микроскопии после окраски по Цилю − Нильсену. Бактериоскопическое исследование не всегда информативно, так как требует наличия высокого титра микроорганизма. Диагностика заболевания основывается также на клинических признаках и гистопатологической картине, поскольку Mycobacterium leprae является некультивируемой.

В настоящее время лепра считается излечимой, но ещё в средние века болезнь охватывала целые континенты. Сейчас на территории нашей страны наблюдаются единичные случаи, однако в связи с наличием большого числа больных в других странах (Индия, Бразилия, Малайзия) и активной миграцией населения, а также тяжёлыми последствиями поздней диагностики заболевания, актуальным является применение современных средств ранней диагностики лепры. Без лечения лепра может приводить к прогрессирующим и стойким поражениям кожи, нервов, конечностей и глаз. Лечение, проведённое на ранних стадиях болезни, позволяет предотвратить инвалидность.

Геном Mycobacterium leprae полностью расшифрован. Уникальность генома заключается в наличии повторяющихся последовательностей четырёх семейств: RLEP, REPLEP, LEPREP и LEPRPT. Показано применение различных маркеров генома Mycobacterium leprae для ранней диагностики присутствия патогена в организме человека. Исследование генома проводится путём полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, современным вариантом которого является использование гидролизующейся пробы.

При обнаружении ДНК Mycobacterium leprae используется амплификация участка повторяющихся элементов RLEP (до 29 повторов в бактериальной хромосоме, отсутствие в геноме прочих видов рода Mycobacterium). Использование семейства повторяющихся элементов с наибольшим показателем копийности RLEP для определения микроорганизмов методом ПЦР показало лучшие результаты в сравнении с генами, традиционно используемыми для идентификации бактериальных геномов (rpoВ, SodA и 16S рРНК). Клиническая практика диагностики в России также показала, что тест-системы, основанные на различных участках генома Mycobacterium leprae, проявляют неодинаковую эффективность.

Анализ проводили на клинических образцах в виде соскобов кожи, носовой слизи, кожного биоптата, полученных от больных с диагнозом «лепра, лепроматозный тип, мультибациллярная форма», находящихся на мониторинге Сергиево-Посадского филиала ГНЦДК Минздрава РФ. Первичная обработка клинических образцов проводилась сотрудниками ГНЦДК.

Генетический материал M. leprae обнаружен в трёх образцах из восьми анализируемых. При этом показано, что концентрация M. leprae в образцах является различной, о чём можно судить по изменениям величины порогового цикла при проведении ПЦР в реальном времени. Показано отсутствие взаимосвязи между концентрацией общей ДНК (смесь ДНК человека и M. leprae) и обнаружением ДНК патогена.

Форма кривых на графиках накопления флуоресцентного сигнала, полученных в ходе проведения эксперимента, свидетельствует о правильном протекании реакции и возможности анализа результатов. Сопоставление значений порогового цикла (Ct) однокопийных генов говорит о практически равной эффективности амплификации при использовании систем для генов SodA и MntH вне зависимости от концентрации ДНК микобактерий лепры в образце. Интенсивность амплификации при использовании системы для гена rpoB оказалась самой низкой, даже при сравнении с системой MntH, имеющей тот же уровень пороговой флуоресценции. Показано отсутствие детекции в одном из образцов ДНК M. leprae системой для однокопийного гена SodA, что вероятно свидетельствует о нестабильной работе такой системы детекции при низких концентрациях микобактерий в образце.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Набор «Проба НК»

• Автоматический гомогенизатор «Tissue Lyser II»

• Cпектрофотометр NanoVue 2000

• ДНК-амплификатор StepOne 5c

• Наборы проб и праймеров для анализа повторяющегося участка генома лепры RLEP и однокопийных генов SodA и MntH

• Набор Leprosy std

Результаты

1. Сравнение тест-систем обнаружения ДНК Mycobacterium leprae в клинических образцах пациентов с диагнозом «лепра» показало наибольшую эффективность тест-системы детекции, основанную на использовании повторяющегося элемента генома Mycobacterium leprae RLEP.

2. Наилучшую эффективность среди тест-систем, основанных на анализе участков однокопийных генов, − марганцевого транспортёра mntH, фермента супероксиддисмутазы sodA, β-субъединицы бактериальной РНК-полимеразы rpoB, − показала система mntH.

3. Наименьшая интенсивность показана для коммерческого набора фирмы Genesig (Великобритания), использующего участок гена rpoB.

Полученные закономерности показаны для разной степени концентраций ДНК M. leprae в клинических образцах пациентов.

Перспективы использования результатов работы

Полученные результаты являются частью работ по созданию диагностического набора для определения генетического материала лепры в клинической практике.

Сотрудничество с учреждением при создании работы

ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России.

Особое мнение

«Возможность принять участие в реальной научно-исследовательской работе возникла благодаря созданию в нашей школе условий для выполнения самостоятельного проекта. Руководство школы сделало всё возможное для того, чтобы мне разрешили работать в научном центре Минздрава России. Из предложенных тем я выбрал исследования в области микробиологии лепры, поскольку хотел узнать больше об этом заболевании и поработать на современном оборудовании. Изучать литературу по выбранному направлению было сложно, особенно английскую, хотя она оказалась более информативна. Этот период теоретической подготовки стал самым сложным. Я смог это сделать при содействии руководителя. Отдельным этапом стала подготовка выступления на конференции, очень волнующим был отбор отправленных тезисов и, конечно же, выступление с докладом. Хотелось рассказать о важности и интересных моментах работы всем желающим, сделать доклад ярким и понятным, запоминающимся и оригинальным. Получение диплома II степени стало приятной неожиданностью, поскольку я выступал впервые публично и просто хотел поделиться с ребятами своими исследованиями»