Оптимизация условий анализа экспрессии сплайсинговых вариантов мРНК гена сурвивина методом ОТ/ПЦР

Актуальность

Cурвивин – белок-ингибитор апоптоза, активно экспрессирующийся в опухолевых и трансформированных клетках. Из-за слабой экспрессии в нормальных дифференцированных тканях сурвивин можно рассматривать в качестве одного из перспективных онкомаркеров.

Цель

Оптимизировать метод совмещённых реакций обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ/ПЦР) для определения экспрессии сурвивина и его сплайсинговых вариантов на клинических образцах опухолей надпочечников и опухолей кожи – меланомах.

Задачи

1. Провести анализ научной литературы по теме исследования.

2. Провести ОТ/ПЦР для определения экспрессии сурвивина и его сплайсинговых вариантов на клинических образцах опухолей надпочечников и опухолей кожи – меланомах.

3. Провести электрофорез продуктов ОТ/ПЦР, окрасить, сфотографировать гели после электрофореза и обработать их.

4. Сделать выводы о возможностях использования тест-системы для определения экспрессии сурвивина и его сплайсинговых вариантов методом ОТ/ПЦР.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Амплификатор

• Установка для электрофореза нуклеиновых кислот

• Компьютер с ПО ImageJ 1.35I

• Химическая посуда

• Химические реактивы

Описание

Работа проводилась в несколько этапов.

1. Оптимизация условий анализа мРНК сурвивина методом ОТ/ПЦР.

В качестве положительного контроля и для подбора оптимальных условий реакции ПЦР с анализируемыми праймерами использовали клеточную линию меланомы человека Bro. Использовали 1 мкг тотальной клеточной РНК, ранее полученной в лаборатории кафедры биологической химии Сеченовского Университета. Одноцепочечную молекулу РНК превратили в ДНК в реакции обратной транскрипции и далее амплифицировали уже одноцепочечную молекулу ДНК, используя традиционную ПЦР. Для конститутивного гена глицероальдегидфосфатдегидрогеназы (GAPDH) температура отжига праймера составляла +57 ˚С, а для праймеров на сурвивин и его сплайсинговые варианты проводили подбор оптимальной температуры отжига.

2. Приготовление агарозных гелей, электрофорез и окрашивание.

Для приготовления агарозных гелей взвесь нагревали в водяной бане с кипящей водой или в микроволновой печи до растворения агарозы. Раствор остудили до 50 °C и добавили бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Пастеровской пипеткой налили по краям формы небольшое количество раствора агарозы. После его затвердения вылили в форму остальной тёплый раствор агарозы и сразу вставили рядом с одним из концов геля гребёнку, от зубцов которой в геле остались лунки для проб. После того как гель полностью затвердел (30–45 мин при комнатной температуре), осторожно удалили гребёнку и поместили гель в электрофорезную кювету. Электрофорез проводили при подаче постоянного тока в кювету. Полученный гель снимали на цифровую фотокамеру Kodak и анализировали изображение на компьютере с помощью программы ImageJ 1.35I. Уровень экспрессии мРНК сурвивина определяли по отношению к уровню экспрессии конститутивного гена GAPDH.

Результаты

1. Выход специфических ампликонов при рассмотренных температурах отжига практически одинаков. Поскольку при более высоких температурах отжига понижается неспецифическое связывание праймеров с матрицей (очевидно, что чем выше температура, при которой проводится отжиг, тем меньше вероятность неспецифичного связывания праймера с матрицей), в качестве оптимальной выбрали температуру отжига, равную +61 °C для всех пар праймеров на разные варианты кДНК сервивина.

Анализ экспрессии сплайсинговых вариантов гена сурвивина

2. На основании электрофореграммы выбрали 28 циклов ПЦР для анализа экспрессии конститутивного гена GAPDH и 33 цикла для разных вариантов сплайсинга мРНК сурвивина. Кроме того, при выборе количества циклов ПЦР учитывали уровень экспрессии анализируемого маркера в конкретном клиническом материале. Поскольку уровень экспрессии сурвивина в меланомных образцах выше, чем при новообразованиях надпочечников, то выбрали 31 цикл для анализа экспрессии исследуемого гена в клетках кожи от здоровых и больных доноров и 33 цикла для образцов опухолевых тканей надпочечников. В некоторых случаях при анализе меланомных образцов, содержащих повышенное количество пигмента меланина, на стадии ПЦР наблюдался его заметный ингибирующий эффект на фермент Taq-полимеразу. Для снижения этого эффекта уменьшили количество вносимой в реакционую смесь РНК в 8 раз.

Данные по оптимальному количеству циклов ПЦР при аплификации различных сплайсинговых вариантов гена сурвивина

Выводы

1. Результаты исследования показывают, что для анализа экспрессии сурвивина в образцах меланомы лучше использовать праймеры на отдельные сплайсинговые варианты этого гена. При использовании праймеров, позволяющих выявлять экспрессию сразу трёх вариантов сурвивина, различия между нормальными и опухолевыми клетками выражены слабее. Для корректного анализа следует использовать образцы клеток кожи с опухолевым и нормальным фенотипом от одного и того же больного.

2. Сурвивин является перспективным диагностическим маркером. Анализ чувствительности реакции ОТ/ПЦР с используемыми праймерами показал возможность детекции мРНК сурвивина и его сплайсинговых вариантов даже в составе 1 нг тотальной клеточной РНК, взятой в качестве матрицы.

3. Оптимизация метода совмещённых реакций обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ/ПЦР) позволяет разработать эффективную тест-систему для определения экспрессии сурвивина и его сплайсинговых вариантов на клинических образцах опухолей надпочечников и опухолей кожи – меланомах.

Перспективы использования результатов работы
Разработанную тест-систему после проверки на большем количестве образцов можно рассматривать для использования при диагностике на подозрение меланом и злокачественных опухолей надпочечников.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет)

Мнение автора

«Во время работы над проектом я получила новые знания и опыт. Я ещё раз убедилась, что хочу связать свою жизнь с биохимией. Мне понравилось работать в лаборатории и чувствовать себя учёным»