Влияние эндогенных активных форм кислорода на репродуктивную систему дрозофилы

Актуальность

Активные формы кислорода (АФК) могут оказывать как физиологическое, так и патологическое действие на организм. В организме поддерживается равновесие между образованием и утилизацией свободных радикалов, нарушение которого может приводить к различным патологиям и является одной из причин старения. Часть АФК продуцируется при помощи фермента   NADPH-оксидазы Duox.  В регуляции образования АФК принимают участие многие ферменты и витамины. Участие витаминов в регуляции свободно-радикальных процессов во взрослом организме многих модельных животных, а также человека хорошо изучено. Но физиологическая роль свободных радикалов в

развитии половой системы и гамет всё же остаётся недостаточно изученной темой.

Цель

Выяснить, как отсутствие NADPH-оксидазы Duox сказывается на формировании половой системы и гамет дрозофилы.

Задачи

1. Оценить плодовитость мух с мутацией CyO по отношению к нормальному

фенотипу при содержании на обычном корме, с добавлением витамина С, с добавлением витамина Е и в условиях окислительного стресса, вызванного ионами кадмия.

2. Определить, влияет ли на плодовитость то, кто был носителем мутации при

скрещивании – самец или самка.

3. Выяснить влияние на развитие половой системы дрозофилы и гамет

добавления в корм высоких доз антиоксидантов – витаминов С и Е.

4. Определить уровень свободно-радикальных процессов, протекающих в

половых органах дрозофилы в зависимости от условий содержания.

5. Установить, как влияет окислительный стресс на развитие половой

системы дрозофилы на фоне мутации CyO, а также возможность снижения его

потенциально вредного воздействия путём добавления в пищу низкомолекулярных антиоксидантов — витаминов.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Центрифуга

• Спектрофотометр

• Дозаторы

• Мухи линии Curly и линии Oregon

• Гомогенизатор

• Гомогенат

• Химические реагенты (фосфатный буфер, соляная кислота, тиобарбитуровая кислота, перекись водорода)

Описание

В работе были использованы мухи линии Oregon (дикий тип, OR) в качестве контрольной линии (нормальный фенотип) и мухи линии с мутацией Curly (CyO). Мух содержали на стандартном лабораторном корме при температуре +25 °С. Для добавления витаминов корм предварительно растапливали, охлаждали до температуры около +40 °С и добавляли витамин С из расчёта 500 мг на 1 мл корма и 1000 мг витамина Е на 1 мл корма. Для создания окислительного стресса использовали сульфат кадмия: в расплавленный корм добавляли 21 мг вещества на 1 мл корма.

Для того чтобы выяснить, влияет ли на плодовитость потомства то, кто является носителем мутации CyO – самец или самка, проводили постановку скрещиваний в прямом и обратном направлении. В первом случае брали самцов линии CyO и самок OR, во втором – самцов линии OR и самок линии CyO. В пробирку помещали по одному самцу и две самки, для каждого направления скрещивания проводилось десять повторов. Через три дня родителей пересаживали на свежий корм и содержали там ещё три дня. Далее анализировали продолжительности жизни потомства и оценивали фертильность.

Для оценки продолжительности жизни потомства из каждого индивидуального скрещивания отбирали по 20 самцов и 20 самок, отсаживали в отдельные пробирки. Проводили ежедневный осмотр пробирок и учитывали погибших особей. Для оценки фертильности подсчитывали количество мух, вылетевших из двух пробирок, для каждого индивидуального скрещивания через 15 дней после постановки скрещивания. Для оценки влияния мутаций на плодовитость было поставлено 10 индивидуальных скрещиваний линии OR, а затем проводилось сравнение количества вылетевших особей.

Чтобы определить, как различные экспериментальные условия влияют на активность свободно-радикальных процессов в половой системе дрозофилы, автор оценивал уровень содержания малонового диальдегида (участвует в перекисном окислении липидов) и активность каталазы (одного из главных антиоксидантных ферментов) в семенниках и яичниках мух. Для этого через пять дней после выхода из куколки препарировали мух, извлекали семенники и яичники и гомогенизировали в 1 мл фосфатного буфера (PBS). Далее проводили центрифугирование при 2000 об/мин 5 минут для осаждения крупных фрагментов органов. На одно определение брали по 30 пар семенников или 20 пар яичников. Затем использовали 300 мкл гомогената для определения активности каталазы и 700 мкл гомогената для определения содержания малонового альдегида (МДА).

Для определения активности каталазы к образцам добавляли 1,8 мл 10 мМ раствора перекиси водорода (опыт) или такое же количество дистиллированной воды (холостая проба). Снижение оптической плотности в результате расщепления перекиси водорода в опытной пробе измеряли против контроля каждые 30 с в течение 3 мин при комнатной температуре при длине волны 230 нм. При расчёте активности использовали средние значения изменения оптической плотности за каждую минуту в течение 3 минут. Полученные значения выражали в ммоль Н₂О₂/мин.

Определение концентрации малонового диальдегида (МДА) проводили следующим образом: к образцу добавляли 0,6 М раствор HCl и 0,06 М раствор тиобарбитуровой кислоты, после чего инкубировали образец в течение 60 минут при +95 °С. В качестве контрольной пробы использовали образец, где лизат был заменён дистиллированной водой. Полученную оптическую плотность при длине волны 532 нм использовали для расчёта содержания МДА в образце.

Результаты

1. На линиях мух с мутацией CyO, которых содержали на кормах с разным количеством витаминов С и Е, а также в условиях экспериментального окислительного стресса, вызванного присутствием в корме солей кадмия, было установлено, что витамины С и Е не влияют на продолжительность жизни дрозофилы. Витамин С не снижает негативное действие окислительного стресса, а витамин Е делает его воздействие не таким разрушающим.

2. Плодовитость мух не изменяется при наличии мутации CyO: средняя плодовитость составила 89,5±10,2 особей для линий OR и 86±11,5 для линии CyO. Внесение дополнительных доз аскорбиновой кислоты также не влияло на плодовитость. Однако при внесении витамина Е наблюдалось незначительное, но достоверное снижение плодовитости в линии CyO. При этом на фоне окислительного стресса в линии мух с мутацией CyO также происходило снижение плодовитости, но оно было не столь значительным, как в линии дикого типа OR.

3. При анализе кривых выживаемости не установлено влияния мутации CyO на продолжительность жизни дрозофил при содержании на стандартном корме: средняя продолжительность жизни составила 40±3,7 дней для линии OR и 39±2,6 дней для линии CyO.

Выживаемость дрозофил в зависимости от присутствия мутации CyO

4. При оценке различий в уровне свободно-радикальных процессов измерением концентрации МДА и активности каталазы было установлено, что уровень генерации свободных радикалов как в яичниках, так и в семенниках не отличался у мух с мутацией CyO от дикого типа при содержании на стандартном корме.

Выводы

1. NADPH-оксидаза Duox играет важную роль на ранних этапах оогенеза дрозофилы.

2. При наличии высоких доз витамина Е на фоне мутации CyO происходит снижение плодовитости мух.

3. NADPH-оксидаза Duox может выступать в качестве продуцента АФК, а также быть акцептором свободных радикалов. Этот эффект зависит от дозы гена.

4. Duox участвует в регуляции распределения белка Oscar в яйцевых камерах дрозофилы по неизвестному пока механизму
5. Чрезмерное употребление антиоксидантов может негативно сказаться на репродуктивной системе.
6. Снижение плодовитости происходило из-за снижения активности каталазы в семенниках и яичниках.

Перспективы использования результатов работы

Многие гены дрозофилы имеют гомологичные гены у человека; таким образом, полученные данные позволяют говорить о ранее неизвестных механизмах участия АФК в функционировании репродуктивной системы человека.

Сотрудничество с учреждением при создании работы

ИБГ РАН

Мнение автора                                 

«Благодаря проекту «Медицинский класс в московской школе» и конференции «Старт в медицину» я приобрела много новых знаний и навыков. Я смогла поработать в научном мире, научилась работать с научными статьями и получила бесценный опыт исследовательской работы»