Влияние эпигенетических модуляторов С-646 и А-485 на секрецию внешней протеазы активатора протеина С и Х фактора

Актуальность

Согласно статистике ВОЗ каждый год в мире от сердечно-сосудистых заболеваний умирают 17,5 миллиона человек. Основная проблема при инфарктах и ишемических инсультах – это тромбы. Много исследований направлено на то, чтобы найти эффективные способы их устранения, так как это не только лечение уже произошедших инфарктов и инсультов, но и их предотвращение. На данный момент средняя распространённость форм наследственного дефицита фактора свёртывания крови Х составляет 1:1 000 000 населения. Но проблема не только в поисках эффективных лекарств, но и в необходимости их удешевления без потери эффективности, а также в возможности наладить массовое производство. Существуют протеазы (ферменты из класса гидролаз, которые расщепляют пептидную связь между аминокислотами в белках), образуемые микромицетами, способные осуществлять реакции расщепления или активации белков системы гемостаза. Так, вид Aspergillius ochraceus способен секретировать протеазы, активирующие Х фактор свёртывания крови и в том числе протеин С. Изучение этого вопроса имеет перспективное значение.

Цель

Определить влияние различных эпигенетических модуляторов на уровень секреции внеклеточной протеазы, активирующей протеин C и X фактор плазмы крови человека, продуцируемой микромицетом Aspergillus ochraceus.

Задачи

1. Выделить внеклеточную протеиназу микромицета Aspergillus ochraceus с высокой активаторной активностью к протеину С и фактору Х.

2. Определить минимальную ингибирующую активность селективных эпигенетических модуляторов при трёхдневном культивировании Aspergillus ochraceus.

3. Провести лабораторный анализ активности протеина С и фактора Х в нормальной плазме по стандартной методике с использованием протеиназы Aspergillus ochraceus, полученной после воздействия эпигенетических модуляторов.

4. Подтвердить гомогенность протеазы Aspergillus ochraceus электрофоретическим методом.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Термошейкер

• Спектрофотометр

• Мультиканальные пипетки

• Центрифуга

• Автоклав

• Планшет

• Камера и блок питания для электрофореза

• Хромогенные субстраты

• Эпигенетические модуляторы

• Реактив Бредфорд

Описание

На первом этапе работы авторами была определена минимальная ингибирующая активность эпигенетических модуляторов С 646 и А 495. Эксперимент был осуществлён методом серийных разведений в 72-луночном стерильном планшете. Анализ данных проводили спектрофотометрически через 24, 48 и 72 часа. Эпигенетические модуляторы С 646 и А 485 не задерживали рост мицелия, что позволяло использовать их в дальнейшей работе.

На следующем этапе было проведено культивирование материала на посевной среде в качалочных колбах объёмом 750 мл с 200 мл питательной среды на орбитальной качалке при 200 об/мин и +28 °С в течение двух дней. По истечении времени 3% (по объёму) посевного материала перенесли в качалочную колбу с 200 мл ферментационной среды и выращивали при вышеописанных условиях ещё в течение трёх суток. В данном эксперименте было три ферментационные среды: контрольная, среда с добавлением 100 μМ эпигенетического модулятора А 485 и среда с добавлением 100 μМ эпигенетического модулятора С 646. На третьи сутки культивирования микромицета культуральную жидкость отделили от биомассы фильтрованием и определили в ней активность протеолитических ферментов. Получены комплексные препараты внеклеточных протеолитических ферментов культуры Aspergillus ochraceus после культивирования в ферментативной среде методом высаливания сульфатом аммония. Затем было выполнено трёхкратное спектрофотометрическое определение количества белка по методу Бредфорд в каждой пробе. Исследован динамический уровень активаторной активности полученных препаратов с протеином С и Х фактором плазмы крови с использованием хромогенных субстратов. Данный этап провёл руководитель проекта (работа с биоматериалом). На основе этих измерений были построены графики активности белка к протеину С и Х фактору. Электрофоретический анализ провели по методу Леммли. На следующем этапе был исследован динамический уровень активаторной активности полученных препаратов с протеином С и Х фактором плазмы крови с использованием хромогенных субстратов. На основе этих измерений были построены графики активности белка к протеину С и Х фактору.

Результаты

1. В результате исследования определена динамика активаторной активности к протеину C в контрольной колбе, в колбах, содержащих C 646 и A 485. Максимальная активаторная активность была зафиксирована в культуральной жидкости, содержащей эпигенетический модулятор C 646, на четвёртые сутки.

Динамика активаторной активности к протеину C

2. Определена динамика активаторной активности к Х фактору в контрольной колбе, в колбах, содержащих эпигенетические модуляторы C 646 и A 485. Максимальная активаторная активность была зафиксирована в культуральной жидкости, содержащей эпигенетический модулятор А 485, на вторые сутки культивации.

3. Денатурирующий электрофорез фермента позволил установить, что протеиназа из Aspergillus ochraceus L-1, селективно активирующая протеин С и Х фактор плазмы крови, представляет собой одноцепочечный белок с молекулярной массой около 33 кДа.

Выводы

1. Эпигенетические модуляторы ацетилирующего типа увеличивают скорость роста мицелиальных грибов.

2. Лабораторный анализ выхода внеклеточных протеиназ при применении эпигенетических модуляторов показал достоверное увеличение секреции белка – активатора протеина C и Х фактора.

3. Существует линейная зависимость между концентрацией эпигенетических модуляторов и биосинтезом протеолитических ферментов.

Перспективы использования результатов работы

Результаты работы могут быть использованы для увеличения выхода фермента-активатора протеина С и Х фактора плазмы крови человека, являющегося потенциальным диагностическим средством параметров системы гемостаза человека.

Сотрудничество с вузами при создании работы

1. МГУ имени М. В. Ломоносова

2. Римский университет Ла Сапиенца (University of Rome La Sapienza)

Награды/достижения

Московский городской конкурс исследовательских и проектных работ школьников – участник.

Мнение автора                                 

«Нам представилась возможность получить полезный опыт работы в области исследовательской деятельности на английском языке. На конференции «Старт в медицину» была удобно организована онлайн-защита. Организаторы оперативно помогли решить возникшие проблемы»