Криоконсервация семенной жидкости в растворе метанол-вода

Актуальность

На сегодняшний день существует проблема с органами для трансплантации, т. к. они имеют очень короткий срок хранения. Поэтому у врачей мало времени для проверки совместимости органов донора с реципиентом и наличия болезней, из-за чего появляются случаи заражения реципиента. Ежегодно умирают более 25 тысяч больных, не дождавшись донора. В этом может помочь крионика. Замораживание органов и клеток позволит сохранять их на более длительный срок. У крупных образцов тканей, таких как кожа, зачастую происходит переохлаждение, из-за того что жидкий азот имеет более низкую температуру, чем температура витрификации внутриклеточной жидкости, что приводит к их растрескиванию. Очень важно отрабатывать технологию заморозки на отдельных клетках, сохранение которых представляет самостоятельную ценность.

Цель

Найти вещество с самой близкой температурой витрификации к температуре витрификации внутриклеточной жидкости.

Задачи

1. Изучить литературу по теме исследования.

2. Изучить жидкости для криосохранения клеток.

3. Определить состав и концентрацию криопротекторного раствора.

4. Определить состав раствора для криоконсервирования.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Термометр

• Микроскоп

• Химическая посуда

• Химические реагенты (диметилсульфоксид (ДМСО), этиленгликоль, метиловый спирт (96%), жидкий азот, метиленовый синий)

Описание

Работа проводилась в компании «КриоРус».

Сначала автор определил эвтектическую температуру 88%-го раствора метилового спирта. Для этого к 42 мл 96%-го раствора метилового спирта добавили 3,36 мл воды и охладили жидким азотом. При температуре -123 °C образовались кристаллы и остался жидкий раствор.

Затем измерили температуру витрификации раствора ДМСО и этиленгликоля.

Для этого приготовили криопротектор: ДМСО и этиленгликоль смешали в пропорции 1:1 и оставили до образования комплекса ДМСО-этиленгликоль.

Следующим этапом было определение минимальной концентрации криопротекторов для витрификации в пробирке. К криопротектору добавляли воду и охлаждали жидким азотом.

Витрификация смесей протекала при разной температуре в зависимости от процентного соотношения криопротектора и воды.

Для охлаждения семенной жидкости была взята смесь 40% криопротектора и 60% воды. Эта концентрация является токсичной при длительном нахождении в клетках, но она подходит, т. к. находится с клетками очень малое время.

Для оценки выживаемости сперматозоидов автор окрасил семенную жидкость 1%-м раствором метиленового синего и добавил в неё криопротекторный раствор. Контрольные образцы изучили под микроскопом. Затем семенная жидкость была охлаждена в жидком азоте.

При ‑75 °C жидкость стала сильно вязкой, при ‑103°C – витрифицировалась.

После витрификации семенной жидкости началось аккуратное согревание, а затем было проведено сравнение образцов до заморозки (контрольные) и после заморозки под микроскопом.

Результаты

1. После нескольких разбавлений и последующих охлаждений были получены следующие результаты:

- при концентрации 50% криопротектора и 50% воды смесь витрифицируется при температуре -103 °С;

- при концентрации 40% криопротектора и 60% воды смесь витрифицируется при температуре -110 °С;

- при концентрации 32,6% криопротектора и 66,3% воды смесь кристаллизуется при температуре -89°С.

2. Сравнение образцов до и после их заморозки показало, что в обоих случаях сперматозоиды имеют неповреждённые головки и хвостики, следовательно, можно сделать вывод, что сперматозоиды остались живыми. Увидеть их активности не удалось, т. к. использованный микроскоп имел 400-кратное увеличение, что является минимальным, чтобы можно было наблюдать движение.

Вывод

Технология с применением раствора метанол-вода может применяться к более крупным образцам, которым нужны более щадящие температуры.

Сотрудничество с учреждением при создании работы

ООО «КриоРус»

Мнение автора

«Я считаю, что моя работа может помочь развитию крионики и принесёт пользу людям»