Получение бактерий, синтезирующих белок лёгкой цепи нейрофиламентов человека (NFL)

Актуальность

Цитоскелет клетки – клеточный каркас, осуществляющий опору клетки и транспорт веществ внутри неё. Цитоскелет нейронов – клеток нервной системы – состоит из нейрофиламентов, микротрубочек и актина.

Белок лёгкой цепи нейрофиламентов человека является маркером многих неврологических заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и нейропатия периферической нервной системы. По анализу крови можно понять, когда концентрация этого белка завышена. Этот показатель служит для диагностики болезни.

Для изучения свойств белка in vitro необходимо получить этот белок в очищенном виде. Белок лёгкой цепи нейрофиламентов экспрессируется (синтезируется) в большом количестве в спинном мозге, что осложняет процедуру его получения из тканей. Используя биотехнологические методы, рекомбинантный белок получают в бактериях Escherichia coli (кишечная палочка).

Цель

Получить белок лёгкой цепи нейрофиламентов (NFL) in vitro.

Задачи

1. Изучить литературу по теме исследования.

2. Получить генетически модифицированные бактерии E. coli С41, содержащие ген белка NFL.

3. Получить белок, синтезируя его в клетках бактерий.

4. Доказать наличие белка с помощью электрофореза, используя контрольный образец с белками известной молекулярной массы.                                            

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Компетентные клетки штамма E. coli С41

• Среда LB для культивирования E. coli С41

• Раствор плазмидной ДНК

• Стерильные пробирки на 1,8 и 15 мл

• Стерильные стаканы

• Термостатируемый шейкер

• Микроцентрифуга

• Водный термостат

• Магнитная мешалка

• Набор реактивов для электрофореза белков

• Автоматические дозаторы переменного объёма со сменными наконечниками

Описание

Автором была изучена литература, посвящённая белку лёгкой цепи нейрофиламентов и биотехнологическим способам получения белков.
Практическая часть работы состояла из 3 этапов, проводилась в ГБОУ Школа № 1517 (этапы 1 и 2) и на базе образовательного партнёра школы – ФИЦ Биотехнологии РАН (этапы 2 и 3).

1 этап. Трансформация бактерий E. coli С41 плазмидой с геном белка NFL

Благодаря трансформации бактерий автор получил на твёрдой питательной среде колонии бактерий с геном белка NFL. Также были высажены бактерии E. coli С41, которые не подвергались трансформации, для последующего контроля образцов. Колонии выращивались при 37 °C в течение 18 часов.

2 этап. Синтез белка в клетках бактерий E. coli C41

Полученные колонии бактерий были пересажены в жидкую питательную среду. Спустя 2 дня при интенсивном перемешивании получено достаточное количество бактерий, которые синтезировали белок лёгкой цепи нейрофиламентов человека. С помощью центрифугирования автор получил концентрированный раствор данных клеток.

3 этап. Обнаружение белка в клетках

Методом электрофореза автор доказал наличие белка NFL в трансформированных клетках E. сoli C41.

В одни пробирки были помещены генетически модифицированные бактерии E. coli C41, отделённые от питательной среды, и добавлено 400 мл воды. В другие – контрольные образцы бактерий E. сoli, не подвергшиеся трансформации, и добавлено столько же воды. После этого образцы в пробирках были подвержены воздействию ультразвука в течение 12 секунд. В результате в пробирках были получены лизаты (содержимое клетки), которые проанализировали с помощью электрофореза. После электрофореза гель был помещён на 15 минут в красящий раствор (Commassi) с постоянным встряхиванием. Далее гель отмыли дистиллированной водой при температуре 80 °C. На полученных гелях в образцах лизата генетически модифицированных бактерий E. coli C41 присутствовала полоса белка, соответствующая по молекулярной массе искомому белку.

Результаты

В результате наращивания бактерий в жидкой среде были получены 2 раствора бактерий: генетически модифицированные и контрольные образцы. Образец генетически модифицированных бактерий был значительно темнее, чем контрольный образец.

После завершения электрофореза и окраски гелей получены 2 геля с полосками белков. На дорожках 4–6 была яркая новая полоса, отсутствующая в немодифицированных клетках на уровне отметки белка-маркера, которая показывает молекулярную массу 66 кДа.

Гели с полосками белков бактерий

Выводы

1. Нейрофиламенты являются важнейшими структурными образованиями нервных клеток. 2. Белок лёгкой цепи нейрофиламентов является маркером многих неврологических заболеваний. Его необходимо получать in vitro из-за сложности его извлечения из спинного мозга человека.

3. Методом трансформации были получены генетически модифицированные бактерии E. coli C41, содержащие ген белка NFL.

4. В жидкой питательной среде в клетках бактерий был экспрессирован белок NFL.

5. С помощью метода электрофореза было доказано наличие изучаемого белка в генетически модифицированных клетках.

Перспективы использования результатов работы

Получение бактерий, способных синтезировать белок лёгкой цепи нейрофиламентов человека, поможет в изучении данного белка in vitro. На данный момент получить этот белок можно только из спинного мозга человека, что достаточно проблематично. Изучение белка способно помочь в поиске лекарства или способа предотвращения таких болезней, как болезнь Паркинсона.

Сотрудничество с учреждением при создании работы

ФИЦ Биотехнологии РАН

Мнение автора

«Проект «Медицинский класс в московской школе» даёт возможность школьникам почувствовать себя настоящими учёными. Благодаря оборудованию школы и образовательным партнёрам школы у меня появилась возможность сделать работу. Сам процесс выполнения мне понравился, ведь я чувствовала, что делаю что-то важное для науки. Конференция «Старт в медицину» даёт возможность учащимся представить свои исследовательские работы, а другим – увидеть, что сейчас актуально в научной сфере, и какие направления будут развиваться в скором будущем или уже сейчас активно развиваются»