Оптимизация условий анализа мРНК генов MAX и MAD с целью определения активности этих генов методом ОТ/ПЦР

Актуальность

Эукариотические факторы транскрипции реализуют механизм регуляции экспрессии генов комбинаторного типа. Молекулы факторов транскрипции обладают консервативными доменами, которые дают им возможность осуществлять высокоспецифические белок-белковые и белково-нуклеиновые взаимодействия. In vivo происходит объединение факторов транскрипции и других регуляторных белков в большие регуляторные комплексы. Каждое новое сочетание факторов придаёт комплексу уникальные регуляторные свойства, обеспечивая изменение специфичности его взаимодействия с регуляторными последовательностями ДНК и регуляторными белками аппарата транскрипции.

Цель

Выявить оптимальные условия анализа экспрессии генов MAX и MAD с целью определения уровня экспрессии их мРНК.

Задачи

1. Проанализировать научную литературу о значении белковых продуктов генов MAX и MAD в регуляции транскрипции.

2. Провести ОТ/ПЦР с целью определения уровня экспрессии мРНК MAX и MAD при различных количествах циклов ПЦР.

3. Провести электрофорез продуктов ОТ/ПЦР.

4. Окрасить, сфотографировать и провести анализ изображений геля после электрофореза.

5. Сделать выводы об оптимальных условиях проведения ОТ/ПЦР относительно числа циклов ПЦР в отношении генов MAX и MAD с целью определения уровня экспрессии их мРНК.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Амплификатор

• Установка для электрофореза нуклеиновых кислот

• Система гель-документирования Syngene G:BOX

• Компьютер с ПО GeneTools v.4.3.8

• Химическая посуда

• Химические реагенты

Описание

Материл для исследования – очищенные гуанидинизотиоционатным методом препараты тотальной клеточной РНК из линии клеток К562 (миелолейкоз человека) – был предоставлен кафедрой биологической химии Сеченовского Университета. Работа выполнялась в несколько этапов.

1. Оптимизация условий анализа мРНК методом ОТ/ПЦР

ОТ-ПЦР представляет собой метод амплификации специфического фрагмента рибонуклеиновой кислоты (РНК). Для оптимизации реакции ОТ/ПЦР использовали ранее полученную тотальную клеточную РНК из линии клеток К562. Одноцепочечную молекулу РНК превращали в комплементарную ДНК в реакции обратной транскрипции и далее амплифицировали уже одноцепочечную молекулу ДНК, используя традиционную ПЦР.

ОТ-ПЦР используется для обнаружения молекул РНК в образце с заранее известным участком последовательности, комплементарным праймеру. Экспоненциальная амплификация при помощи ОТ-ПЦР является чувствительной методикой, с помощью которой может быть обнаружено малое количество молекул РНК. Часто ПЦР в реальном времени комбинируют с ОТ/ПЦР для измерения малых количеств мРНК, что позволяет получать количественную информацию о содержании данной мРНК в клетке и, соответственно, судить об уровне экспрессии данного гена в отдельной клетке или ткани. В ходе работы провели различное число циклов ПЦР, подбирая оптимальное количество по выходу ОТ/ПЦР-продукта (ампликона). Работа с РНК (добавление РНК в смесь ОТ/ПЦР) проводилась под ламинаром, в перчатках и в маске.

2. Приготовление агарозных гелей, электрофорез и окрашивание

Навеску агарозы заливали буферным раствором 1хТВЕ. Взвесь нагревали на водяной бане при +100 °C или в микроволновой печи до тех пор, пока агароза не растворилась. Затем раствор охлаждали до +50 °C и добавляли бромистый этидий (из водного раствора, содержащего 10 мг/мл и хранящегося при +4 °C в светонепроницаемом сосуде) до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Быстро заливали агарозу в электрофорезную камеру. Полимеризацию геля проводили при комнатной температуре в течение 30–45 мин. и затем осторожно удаляли гребёнку и помещали гель в электрофорезную кювету. Добавляли достаточное количество электрофорезного буфера, так, чтобы гель был закрыт слоем буфера толщиной 1–2 мм. Смешивали пробы с буфером для нанесения пробы и вносили их в лунки геля под электрофорезный буфер. Электрофорез проводили при подаче постоянного тока в кювету. ДНК в геле окрашивалась флуоресцирующим красителем – бромистым этидием.

3. Документирование и анализ цифрового изображения

Гели снимали на цифровую фотокамеру в системе гель-документирования и проводили анализ изображения на компьютере с помощью специализированного программного обеспечения. Уровни экспрессии исследуемых генов нормализовали по отношению к уровню экспрессии конститутивного гена (β-актина), который принимали за единицу (отн. ед.). Уровень экспрессии исследуемого гена:

- ниже 0,15 отн. ед. расценивали как очень низкий,

- от 0,15 до 0,29 отн. ед. – низкий,

- от 0,3 до 0,54 отн. ед. – средний,
- от 0,55 до 0,99 отн. ед. – высокий,

- выше 1 отн. ед. – очень высокий (гиперэкспрессия).

Результаты

1. Получена фотография, иллюстрирующая интенсивность свечения окрашенного продукта реакции для генов МАХ и МАD в зависимости от количества циклов реакции ОТ/ПЦР.

Как видно из представленных данных, наибольшее количество продуктов начинает накапливаться после 35 циклов.

2. Результаты анализа изображений на компьютере. При этом уровни экспрессии исследуемых генов нормализовали по отношению к уровню экспрессии конститутивного гена (β-актина).

Выводы

1. Для гена МАD и для гена МАХ при проведении ОТ/ПЦР оптимальными при выбранных условиях будут 35 циклов.

2. Следовательно, относительные уровни экспрессии мРНК генов MAX и MAD можно эффективно анализировать методом ОТ/ПЦР при одинаковом температурном режиме и оптимальном количестве циклов ПЦР.

Перспективы использования результатов работы

Метод, оптимизированный в результате работы, даёт возможность оценить соотношение активностей генов МAX и MAD и прогнозировать пути регуляции (репрессии или активации) транскрипционной активности важного фактора с-Мус.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), кафедра биологической химии