Накопление астаксантина в пищевых цепях и оптимизация его биогенного синтеза

Цель
Исследование возможности оптимизации биогенного синтеза астаксантина при внедрении дафний в пищевую цепь: гематококкус – моллинезия.

Описание

В состав мяса обитателей морских глубин наравне с ценнейшим рыбьим жиром входит антиоксидант, каротиноид астаксантин, борец со свободными радикалами. Это вещество широко применяется в медицине при лечении диабета, болезней почек, в кардиологии, имеет противовоспалительный эффект, повышает иммунитет. Микроводоросль Haematococcus (гематококкус) – это богатейший источник астаксантина, который вырабатывается в фазе покоя для защиты от ультрафиолетового излучения и окисления. Клетки водоросли могут содержать от 1,5 до 4% астаксантина  по массе. Также источником астаксантина являются дрожжи Phaffia, но они содержат гораздо меньше астаксантина, чем микроводоросли Haematococcus. Сейчас большинство ценных видов рыб разводят в неволе, и вопрос их кормов стоит достаточно остро: выделять астаксантин из водорослей гематококкуса и добавлять в корм достаточно дорого из-за его невысокой экстракции. Так можно ли каким-то образом увеличить биогенный синтез астаксантина без серьёзных финансовых затрат?

Гипотеза: если в пищевую цепь между водорослями и рыбой внедрить дафний, то содержание астаксантина в мясе рыбы будет выше, чем без участия дафний.
Задачи:
1. Провести анализ литературных источников по следующим вопросам: свойства и особенности астаксантина, условия его синтеза, условия разведения дафний, гематококкуса, моллинезии. Дафнии и моллинезия-парусник являются оптимальными объектами исследования, поскольку первые достаточно быстро размножаются и служат кормом для рыб, а вторая из-за прозрачного тела может служить индикатором уровня поглощённого астаксантина.
2. Вырастить необходимое количество гематококкуса, дафний и приобрести рыбу моллинезию.
3. Подобрать методики и поставить серию экспериментов по обнаружению астаксантина в дафниях и моллинезии.
4. Рассчитать выход астаксантина в заданных условиях.

Для достижения партеногенетического размножения дафний они содержались в 30-литровой ёмкости, которая постоянно освещалась и продувалась с помощью компрессора. Кормление производилось через сутки разведёнными в воде дрожжами до лёгкого помутнения воды. Культуру Haematococcus pluvialis (гематококкуса) разлили в несколько ёмкостей в приготовленную нами среду BG-11 и культивировали при естественном освещении на подоконнике. Фильтрация дафний производилась с помощью мельничного газа. Для контрольного эксперимента были взяты дафнии, выращенные с использованием дрожжей. Для других опытов дафнии сокультивировались с Haematococcus pluvialis на протяжении 1, 4, 7 и 14 суток. После прекращения эксперимента дафнии отмывались от суспензии микроводорослей с помощью переноса пастеровской пипеткой организмов в чистую среду несколько раз. Далее дафнии вновь отделялись от жидкости с помощью мельничного газа и высушивались в эксикаторе над безводным CaCl2. Высушенных дафний взвешивали, делили на 3 части и раскладывали в микроцентрифужные пробирки. В каждую пробирку наливали по 1 мл диметилсульфоксида (DMSO). Смесь на сутки помещали в термостат с температурой 37ºС. После этого центрифугировали на 3000 об/мин на протяжении 5 мин. Надосадочная жидкость отделялась пипеткой и переносилась в чистую пробирку для спектрофотометрического исследования.
По закону Бугера – Ламберта − Бера поглощение (А) является произведением длины оптического пути (L) на коэффициент экстинкции (E) и концентрацию (C) вещества: A=E*L*C. Отсюда можем выразить концентрацию: С=А/(E*L). Вычислим концентрацию в растворе ДМСО для каждого образца. Экстракция из образца производилась 3 мл ДМСО. Затем вычислили массу вещества в исходной навеске и массовую долю (в процентах) астаксантина в сухой массе дафний. Для получения более точных результатов вычли из экспериментальных данных значение концентрации отрицательного контроля.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• культуры дафний и гематококкуса
• термостат
• аналитические весы
• спектрофотометр ПЭ-5400ВИ
• центрифуга ПЭ-6926
• эксикатор
• реактивы и лабораторное оборудование школьной конвергентной Курчатовской лаборатории.

Результаты
1. Daphnia sp. показали способность к повышению концентрации астаксантина, что говорит о возможности их использования в целях увеличения концентрации исследуемого вещества, так как в гематококкусе концентрация астаксантина не превышает 4%.
2. Четырехдневный срок – максимально эффективный период сокультивирования, поскольку данные по концентрации астаксантина, начиная с 4-х суток, − одного порядка.
3. Моллинезия велифера, выращенная на дафниях, сокультивированных с гематококкусом, имеет более красный цвет по сравнению с контрольными экземплярами, выращенными на «дрожжевых» дафниях, что подтверждает нашу гипотезу.