Проекты

Полиморфизм гена MC1R

Работа призёра конкурса проектов и исследований «Старт в медицину» открытой городской научно-практической конференции «Старт в медицину» в секции «Биотехнология и биоинженерия в медицине»

Направление работы: Биотехнология, Молекулярная биология
Авторы работы: ГБОУ Школа № 2097
Предметы: Биология
Классы: 11 класс
Мероприятия: Конкурс проектов и исследований «Старт в медицину» открытой городской научно-практической конференции «Старт в медицину» 2021 года

Актуальность

Мутации вызывают нарушения в работе генов или приводят к изменению состава и структуры белка, кодируемого геном. Изменённая структура белка может привести к потере функциональности или к изменению его свойств.

В медицине изучение полиморфизма гена МС1R является актуальным при исследовании риска развития опасного заболевания – рака кожи (меланома), так как этот ген влияет на изменение пигментации кожи. Предполагается, что полиморфизм этого гена связан с образованием веснушек.

Цель

Провести анализ нуклеотидной последовательности гена MC1R, выделенного у человека с мутацией, ассоциированной с образованием веснушек.

Задачи

1. Найти последовательности гена MC1R в генетической базе данных.

2. Разработать праймеры для клонирования фрагмента гена MC1R.

3. Клонировать фрагмент гена MC1R.

4. Провести анализ клонированных последовательностей на наличие мутаций, связанных с образованием меланомы.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

Амплификатор

Центрифуга

Термостат

• Источник питания и камера для электрофореза

Описание

Разнообразие вариантов MC1R обуславливает разнообразие цвета кожи и волос в различных этнических группах, связано с образованием веснушек и вызывает риск развития меланомы. Для изучения полиморфизма автор работы клонировал фрагмент гена MC1R. Для клонирования был выбран участок гена, содержащий полиморфизмы, приводящие к замене аминокислот (R160W, R151C и D294H). Эти замены являются факторами риска развития меланомы, а также ассоциированы с развитием веснушек. Для проведения исследования была выделена геномная ДНК из буккального эпителия у людей с веснушками и без них, были подобраны специфичные праймеры для амплификации исследуемого участка гена MC1R и программа проведения ПЦР. Полученные последовательности сравнили с известными последовательностями MC1R.

Этапы работы:

1. Для начала исследовательской работы было необходимо найти нуклеотидную последовательность изучаемого гена MC1R. Поиск последовательности проводили в генетической базе данных NCBI (The National Center for Biotechnology Information). В нуклеотидной последовательности гена MC1R были найдены участки, соответствующие факторам риска развития меланомы.

2. Для амплификации целевого участка гена MC1R были подобраны праймеры, комплиментарные началу и концу этого участка. Праймеры подбирали с использованием олигокалькулятора Oligo Calc: Oligonucleotide Properties Calculator. Подобранная пара праймеров позволяет амплифицировать целевой участок гена размером около 500 п.н.

3. Выделение ДНК из буккального эпителия (эпителия внутренней стороны щеки) производилось с помощью набора реагентов «Проба-Экспресс» по протоколу фирмы-производителя.

4. Для проверки качества выделенной ДНК был проведён электрофорез ДНК в агарозном геле.

5. Амплификацию фрагментов геномной ДНК для клонирования проводили с помощью ПЦР, затем осуществили электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле. Для проведения клонирования гена нужно накопить его последовательность в большом количестве с помощью ПЦР. Для этого провели расчёт ПЦР для 5 образцов, в качестве матрицы использовали исследуемую ДНК.

6. Полученный ПЦР-продукт очистили из реакционной смеси с использованием набора готовых реагентов Cleanup Mini по протоколу фирмы-производителя. Очищенный ПЦР-продукт отдали на секвенирование в ЦКП «Биотехнология» ФГБНУ ВНИИСБ.

7. Полученные нуклеотидные последовательности сравнили между собой с помощью программы Clustal Omega.

8. Затем нуклеотидные последовательности были транслированы в аминокислотные последовательности при помощи биоинформатического онлайн-инструмента Translate tool – ExPASy и проанализированы на наличие факторов риска развития меланомы.

9. Для установления родственных связей между полученными последовательностями белка MC1R и уже известными было построено филогенетическое дерево. Для этого использовали программу MEGA-Х (алгоритм Maximum likelihood).

Результаты

1. Сравнительный анализ показал, что клонированные последовательности сходны с Homo sapiens на 99–100%, с приматами – на 94%.

2. Последовательности гена MC1R «с веснушками» и «без веснушек» различаются в один нуклеотид, который не приводит к изменению белка.

3. Филогенетический анализ показал, что клонированные последовательности гена MC1R относятся к европейскому типу.

4. Факторы риска развития меланомы отсутствуют.

Выводы

Благодаря результатам исследования были получены праймеры и последовательности, которые в дальнейшем будут использоваться для изучения разнообразия гена MC1R.

Перспективы использования результатов работы

Результаты работы могут быть использованы в дальнейшем для изучения полиморфизма гена MC1R.

Сотрудничество с учреждением при создании работы

ФГБНУ ВНИИСБ

Награды/достижения

1. XLV Городской ежегодный конкурс исследовательских работ «Мы и биосфера» в рамках Городской конкурсной программы «Новые вершины», секция «Общая биология и медицина» – лауреат I степени.

2. XXX Открытая московская инженерная конференция школьников «Потенциал», секция «Медицина и генетика» – диплом II степени.

3. Международная научно-практическая конференция «Вавиловские чтения – 2020» – диплом II степени.

Мнение автора

«Данная работа имеет большое значение для меня, так как в будущем я планирую связать свою жизнь с медициной и профессией врача, поэтому мне важно понимать принцип работы современных методов исследования, которые могут использоваться в разных областях, особенно в генетической терапии. Хочу выразить огромную благодарность руководителям работы и конкурсу «Старт в медицину» за то, что они дают возможность погрузиться в науку и узнать много нового и интересного уже в школьном возрасте»