ДНК-метилтрансфераза M.SSSI: выделение и метилирующая активность

Актуальность

В настоящее время метилирование ДНК является предметом пристального изучения в связи с выяснением того факта, что оно играет важную роль в регуляции многих клеточных процессов. У прокариот метилирование ДНК обеспечивает защиту клетки от внедрения чужеродной ДНК. У эукариот оно отвечает за контроль экспрессии генов, поддержание целостности генома, эмбриональное развитие и другие жизненно важные функции.

Метилирование ДНК осуществляется специфическими ферментами, ДНК-метилтрансферазами (МТазы). M.SssI является прокариотической МТазой, узнающей в ДНК короткую последовательность – CpG. Ввиду того, что эта последовательность совпадает с участком узнавания эукариотических МТаз, M.SssI может служить моделью для изучения механизма узнавания CpG-участка эукариотическими МТазами.

Данные об организации фермент-субстратного комплекса M.SssI с ДНК практически отсутствуют. Структурные исследования требуют дополнительных анализов фермента M.SssI, тем не менее, число работ по получению данного белка крайне ограниченно.

Цель

Выделить фермент M.SssI в виде гексагистидинового производного и изучить метилирующую активность на ДНК фага лямбда (λ).

Задачи

1. Выделить белок M.SssI из культуры E. сoli ER 1821.

2. Определить метилирующую активность M.SssI на ДНК фага λ.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Спектрофотометр Cary Eclipse (Varian)

• Кварцевые кюветы фирм Starna Cells и Hellma

• Микроцентрифуга Eppendorf-5414S

• Автоматические дозаторы Gilson и Eppendorf

• Потенциометр UltraBasic

• Реактивы

Описание

В процессе работы автором были изучены общие сведения о С5-цитозин-ДНК-метилтрансферазах, метилирование ДНК, катализируемого ДНК-метилтрансферазами, в частности, ДНК-метилтрансфераза M. SssI. Проведено исследование, объектами изучения которого являлись фермент M. SssI и ДНК фага λ.
Работа состояла из нескольких этапов.

1. Выращивали трансформированные клетки в две стадии:

– посев клеток на чашку Петри с ампициллином для отбора клеток, содержащих плазмиду с геном устойчивости;

– рост ночной культуры в присутствии ампициллина с последующим разбавлением. Контроль роста бактерий осуществлялся методом УФ-спектроскопии до оптической плотности OD 600 = 0,6.

2. Индукция экспрессии белка посредством добавления изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (ИПТГ) и дальнейшее центрифугирование.

3. Ультразвуковое разрушение бактерий.

4. Отделение клеточного дебриса.

5. Металл-аффинная хроматография на Со²⁺-содержащей смоле TALON: нанесение лизата на колонку, промывание колонки буфером для озвучивания, содержащим 20 мМ имидазола, промывание буфером, содержащим 40 мМ имидазола, снятие белка с колонки буфером А, содержащим 150 мМ имидазола (фракции 300, 400, 500, 600 мкл). Основная часть белка выходила во фракции объёмом 600 мкл.

6. Переведение белка в буферный раствор методом диализа для хранения. Чистоту препарата M. SssI определяли с помощью гель-электрофореза по Лэммли.

7. Определение метилирующей активности M. SssI проводили с помощью ДНК фага λ. Реакционную смесь анализировали на геле агар-агар (0,8%).

Результаты

1. Для получения M. SssI был использован штамм E. сoli ER 1821. Клетки содержали плазмиды pCAL/nH, кодирующие МТазу M.SssI с кластером из шести остатков гистидина на N-конце. Посев клеток на чашку Петри с ампициллином позволил отобрать клетки, содержащие плазмиду с геном устойчивости к этому антибиотику.

2. В результате из 1 литра культуры удалось выделить 1,6 мг белка с высокой степенью очистки. Установленная чистота препарата M.SssI методом гель-электрофореза по Лэммли составляет более 95%.

3. Элюат с концентрацией имидазола 150 мМ содержал белок с ожидаемой молекулярной массой (44 кДа).

4. Фермент проявлял склонность к агрегации при диализе, поэтому в качестве диализного буфера использовали двукратный рабочий буфер, содержащий 0,02% неиспользованного ПАВ Triton X-100 (буфер Б).

Выделение M. SssI. Анализ фракций в электрофорезе в 12,5% полиакриламидном геле по Лэммли

1 – белковые маркеры молекулярной массы, 2 – лизат, 3 – проскок, 4 и 5 – маркеры БСА (66 кДа), 6–9 – фракции M. SssI 300, 400 и 600 мкл после элюции раствором 150 мМ имидазола.

5. Метилирование ДНК анализировали по защите ДНК фага λ от расщепления эндонуклеазой рестрикции R. Hin 6I. В результате определили, что молекулы ДНК, не подвергшиеся метилированию, подвергаются гидролизу с образованием более коротких цепочек ДНК, при этом метилированные молекулы ДНК защищены от расщепления.

6. Для анализа в качестве контроля использовали МТазу M. HhaI, который практически полностью защищал ДНК фага λ от расщепления R. Hin 6I.

Изучение активности M. SssI по защите от расщепления ДНК фага λ эндонуклеазой рестрикции R. Hin 6I в 0,8% агарозном геле в присутствии бромистого этидия

1 – ДНК фага λ, 2 – ДНК с R. Hin 6I, 3 – смесь R. Hin 6I с ДНК после обработки M. HhaI,

4 – смесь R. Hin 6I с ДНК после обработки M. SssI.

Выводы

M.SssI почти полностью защищает ДНК фага λ от расщепления R.Hin6I. Неметилированные молекулы ДНК подвергаются гидролизу с образованием более коротких цепочек ДНК, а метилированные молекулы ДНК защищены от расщепления.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), Институт фармации им. А. П. Нелюбина