Оптимизация метода FISH на бактериях

Актуальность

Грамположительные бактерии имеют очень плотную клеточную стенку, поэтому ДНК-пробы плохо проникают в бактерию, и стандартный метод окрашивания по Граму не является информативным. В таких случаях можно применить флуоресцентную in situ гибридизацию, или метод FISH (англ. fluorescence in situ hybridization – FISH). Это цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ.

Цель

Провести сравнительный анализ результатов проведения флуоресцентной in situ гибридизации для детекции бактерий с использованием фермента лизоцима и без него.

Задачи

1. Изучить теоретический материал по теме исследования.

2. Освоить навыки приготовления бактериальных препаратов.

3. Оптимизировать приготовление препаратов для флуоресцентной in situ гибридизации (FISH).

4. Провести флуоресцентную in situ гибридизацию с использованием фермента лизоцима.

5. Идентифицировать бифидобактерии и бациллы с помощью метода FISH.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Термошкаф
• Термостолик
• Весы аналитические
• Флуоресцентный микроскоп Zeiss, снабжённый цифровой камерой Axio Cam MRm
• Лабораторная посуда (пробирки микроцентрифужные (Эппендорфа), предметные и покровные стекла, дозаторы)
• Химические реагенты
• Флуоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды («Синтол», Россия)

Описание

Объектами исследования были фиксированные бифидобактерии (Bifidobacterium) и бациллы (Bacillus).

Изучив методику приготовления бактериальных препаратов, автор решил сократить число предметных стёкол для проведения эксперимента без потери качества проводимого анализа. Для этого он нанёс на одно стекло сразу 4 капли бактериальной смеси бифидобактерий. После высыхания капель автор убедился в том, что капли не соприкасались друг с другом и смешения препаратов не произошло. Проведённый FISH-анализ показал, что на все капли метка села одинаково.
Затем была проведена флуоресцентная гибридизация in situ на бифидобактериях с использованием фермента лизоцима и без него.
Для идентификации в суспензии бифидобактерий и бацилл с помощью метода FISH взяли 2 предметных стекла, нанесли на них смесь бифидобактерий и бацилл. Одно стекло обработали ферментом лизоцимом. Провели стандартную процедуру флуоресцентной in situ гибридизации и с помощью микроскопа визуализировали полученные результаты.

Результаты

1. При нанесении 4 капель на одно предметное стекло капли не соприкасались друг с другом, смешения препаратов не произошло. Проведённый FISH анализ показал, что на все капли метка села одинаково.
2. Сравнительный анализ флуоресцентной in situ гибридизации показал, что проба лучше гибридизуется при обработке ферментом лизоцимом. На фотографиях видно численное преимущество окрашенных в зелёный цвет гибридизовавшихся ДНК.

3. При помощи метода FISH удалось идентифицировать в бактериальной смеси разные виды бактерий, которые нельзя определить стандартными методами (например, по Граму).

Выводы

1. При оптимизации приготовления бактериальных препаратов возможно сократить число препаратов с четырёх до одного, тем самым сократить число использованных стёкол. Увеличение числа капель на одном стекле не влияет на процесс гибридизации.

2. Использование фермента лизоцима увеличивает проницаемость клеточной стенки бактерии, что позволяет пробе легче проникнуть к бактериальной ДНК.

3. Метод FISH позволяет идентифицировать разные виды грамположительных бактерий, что не удаётся выполнить с помощью стандартного метода окрашивания по Граму.

Перспективы использования результатов работы

Данный метод достаточно прост и позволит быстро и точно выявить в бактериальной смеси патогенные бактерии. Его можно применять при контроле микрофлоры кисломолочных продуктов.

Сотрудничество с учреждением при создании работы

ФГБНУ ВНИИСБ, лаборатория прикладной геномики и частной селекции сельскохозяйственных растений.

Мнение автора

«Жаль, что конференция «Старт в медицину» прошла дистанционно. Послушать других участников было бы очень интересно и познавательно»