Использование методов анализа уровней теломеразной активности в выявлении онкопатологий мочевого пузыря

Актуальность

Одним из наиболее перспективных универсальных онкомаркеров сегодня является теломераза. Этот уникальный для человеческого организма фермент – обратная транскриптаза – является ключевым для поддержания стабильности генетического аппарата клетки в процессе многократного её деления.

Теломеразная активность является универсальным маркером для 85% злокачественных опухолей. Это позволяет разрабатывать современные высокочувствительные и высокоспецифичные наборы для диагностики большинства злокачественных новообразований, в том числе на ранних стадиях заболевания. Существующие методы определения активности теломеразы считаются недостаточно эффективными, когда анализируется недостаточное количество клеточного материала. Это делает невозможным проведение неинвазивного варианта диагностики ряда заболеваний. В связи с этим разработка более чувствительных вариантов определения активности теломеразы остается крайне актуальной задачей биологии и медицины.

Цель

Повысить эффективность классического TRAP-анализа.

Задачи

1. Провести полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и классический TRAP-анализ.

2. Провести анализ по модифицированному методу RT-TRAP-2PCR.

3. Сравнить результаты анализов.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Амплификатор для проведения ПЦР в режиме реального времени

• Прибор для электрофореза

• Фотокамера Kodak

Описание

В процессе выполнения данной работы автором было проведено исследование, состоящее из нескольких этапов:

1. Анализ образцов лизатов клеточной линии К562 (хронический промиелолейкоз человека), содержащих различное количество клеток и эквивалентных различному уровню теломеразной активности, методом RT-TRAP-2PCR.

2. Электрофорез продуктов TRAP-анализа активности теломеразы в экстрактах клеточной линии К562, содержащих различное количество клеток и эквивалентных различному уровню теломеразной активности.

3. Электрофорез продуктов TRAP-анализа активности теломеразы в клеточных экстрактах, полученных из клеточного осадка мочи и образца ткани после проведения биопсии у пациента с диагнозом – рак мочевого пузыря (РМП).

4. Получены кривые накопления продуктов амплификации теломерных повторов методом RT-TRAP-2PCR в образцах реакционных смесей лизатов клеточного осадка мочи и ткани этого же пациента. Эти результаты свидетельствуют в пользу более высокой чувствительности определения активности теломеразы методом RT-TRAP-2PCR по сравнению с неизотопным методом TRAP.

Результаты

1. В результате анализа образцов лизатов клеточной линии К562, содержащих разное количество клеток и эквивалентных различному уровню теломеразной активности (АТ), методом RT-TRAP-2PCR было установлено значение порогового цикла (Ct) для положительного контрольного образца, содержащего 100 клеток, имеющих активированную теломеразу, равное 4 (Ct = 4), для высокой АТ – 6, для средней АТ – 11, для низкой АТ – 12 и для К – 19.

Анализ образцов лизатов клеточной линии К562, содержащих различное количество клеток и эквивалентных различному уровню теломеразной активности, методом RT-TRAP-2PCR: 100% АТ (К+) – положительный контрольный образец; 80% АТ – образец с высокой, 40% – образец со средней, 10% АТ – образец с низкой теломеразной активностью; 0% АТ (К-) – отрицательный контрольный образец

2. Результаты анализа этих же образцов с использованием классического метода TRAP с электрофоретическим разделением продуктов ПЦР и цифровым анализом изображения в геле. Как следует из результатов, при анализе активности теломеразы лизатов клеточной линии К562 классическим методом TRAР в образце с низкой теломеразной активностью (10% АТ от К+) классические TRAP-продукты практически не наблюдались, что свидетельствует о недостаточной чувствительности этого метода анализа активности теломеразы.

Электрофорез продуктов TRAP-анализа активности теломеразы в экстрактах клеточной линии К562, содержащих различное количество клеток и эквивалентных различному уровню теломеразной активности (10% электрофорез в полиакриламидном геле, окрашенный красителем SYBR Gold, фотография в УФ-свете): 1 – положительный контрольный образец (100% АТ); 2 – образец с высокой (80% АТ от К+); 3 – образец со средней (40% АТ от К+); 4 – образец с низкой (10% АТ от К+) теломеразной активностью; 5 – отрицательный контрольный образец (0% АТ)

3. Анализ белковых экстрактов из образцов клеточного осадка мочи (дорожки 1–4) и ткани мочевого пузыря (дорожки 5–8) показал различное содержание белка экстракта: 8 мкг (дорожки 1 и 5), 4 мкг (дорожки 2 и 6), 2 мкг (дорожки 3 и 7), 0,7 мкг (дорожки 4 и 8).

Электрофорез продуктов TRAР-анализа активности теломеразы в клеточных экстрактах, полученных из клеточного осадка мочи и образца ткани после проведения биопсии у пациента с диагнозом РМП (стадия TIN0M0G1) (10% электрофорез в полиакриламидном геле, окрашенный красителем SYBR Gold, фотография в УФ-свете)

Таким образом, наблюдались характерные дискретные полосы TRAP-продуктов, свидетельствующие о наличии активности теломеразы в данных образцах.

4. При анализе активности теломеразы в этих же экстрактах методом RT-TRAP-2PCR видно, что как при анализе ткани (кривые 5–8), так и клеточного осадка мочи (кривые 1–4) пациента с РМП кривые, характеризующие активность теломеразы, достоверно отличались от отрицательного контрольного образца.

Эти результаты свидетельствуют в пользу более высокой чувствительности определения активности теломеразы методом RT-TRAP-2PCR по сравнению с неизотопным методом TRAP.

Анализ активности теломеразы методом RT-TRAP-2PCR в клиническом материале пациента с РМП: К+ - положительный контрольный образец (100% АТ); К- – отрицательный контрольный образец (0% АТ)

Выводы

Модификация метода TRAP в реальном времени позволяет повысить чувствительность метода анализа активности теломеразы и даёт возможность подойти к количественному анализу теломеразной активности.   

Перспективы использования результатов работы

Ген TRF1 может использоваться в качестве онкомаркера.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), кафедра биологической химии.