Создание растений-биосенсоров на тяжёлые металлы

Актуальность

Актуальность работы определяется тем, что загрязнение почв тяжёлыми металлами выходит на первое место среди всех видов загрязнений как по количественным показателям, так и по опасности для окружающей среды. Получение растительного маркера, отвечающего на загрязнение синтезом флуоресцентного белка, поможет вовремя диагностировать проблему и предотвратить её последствия.

Цель

Создать генетический инструментарий, который позволит осуществить перенос требуемых генов в растительный геном.

Задачи

1. На основе литературных источников изучить флуоресцентные белки и тяжёлые металлы, а также методы, используемые в генной инженерии.

2. Подобрать методы проведения исследования.

3. Создать необходимую генетическую конструкцию для модификации растений.

Оснащение и оборудование, использованное в работе
• Спектрофотометр
• Центрифуга
• Амплификатор
• Термостат
• Качалка для культивирования
• Ламинарный бокс
• Лабораторная посуда

Описание

Работа проведена на базе лаборатории геномной инженерии МФТИ.

Процесс создания целевой генетической конструкции был разделён на два этапа:

1. Дизайн конструкции in silico.

2. Создание конструкции с применением методов молекулярной биологии.

Для работы автор выбрал бинарный вектор на основе плазмиды pCambia. В данном векторе уже находится ген флуоресцентного белка ZsGreen под контролем конститутивного промотора 35S вируса мозаики капусты. Было решено заменить исходный промотор на prCdI19, который расположен на пятой хромосоме в геноме растения Резуховидка Таля (Arabidopsis thaliana). Нуклеотидная последовательность данного промотора взята из базы данных NCBI (accession number CP002688). Во время дизайна конструкции был продуман ход эксперимента: выбраны праймеры для клонирования и скрининга конструкций, подобраны рестриктные сайты.

На первом этапе была выделена геномная ДНК Arabidopsis thaliana, которую далее использовали для наработки фрагмента ДНК, содержащего промоторную область CdI19. Затем провели полимеразную цепную реакцию (ПЦР), используя праймеры, выбранные ранее (prCdl19 F HindIII, prCdl19 R KpnI), которые содержали на концах рестриктные сайты HindIII и KpnI, необходимые в дальнейшем для рестрикции. В результате ПЦР был получен продукт, который отмечен на схеме как Amplified CdI19.

При прямом клонировании амплифицированных вставок в большие плазмидные векторы (размерами более 10kb) часто возникают проблемы, поэтому сначала было решено поместить данный промотор в небольшую плазмиду pSL1180 (3,4kb). Далее провели реакцию рестрикции для ампликона и вектора pSL1180 по указанным рестриктным сайтам. В результате рестрикции на концах молекул формируются комплементарные липкие концы, которые затем сшиваются в реакции лигирования с образованием новой конструкции pSL1180 + CdI19.

Реакционной смесью после завершения лигирования трансформировались бактериальные клетки E.coli штамм XL1-Blue. Полученные одиночные колонии были проверены на наличие целевой конструкции с помощью праймеров M13 F и M13 R. Затем автор нарастил бактериальные клетки и выделил плазмидную ДНК. Данный этап необходим для наработки в больших количествах нужной плазмиды, поскольку реакция лигирования протекает с низкой эффективностью. Выход целевых конструкций крайне мал, чтобы продолжать манипуляции без этапа наработки плазмид в живых клетках.

Затем провели реакцию рестрикции для выделенных плазмид, вырезав prCdI19 по рестриктным сайтам HindIII и KpnI. С помощью рестрикции удалили промотор 35S из конструкции pCambia 35S-ZsGreen. Полученные фрагменты были сшиты в реакции лигирования с образованием конструкции pCambia prCdI19-ZsGreen.

Автор трансформировал бактериальные клетки E.coli штамм XL10-Gold реакционной смесью после лигирования. Полученные клетки проверили на наличие нужной конструкции. Затем автор нарастил бактериальные клетки на жидкой среде и выделил ДНК, которую проанализировали с помощью секвенирования по Сэнгеру. Данный метод позволяет точно определить последовательность нуклеотидной цепи.

Результаты

1. Создана генетическая конструкция для модификации растений.

2. Полученная автором последовательность нуклеотидной цепи полностью соответствовала ожидаемой, не было замен, вставок или делеций нуклеотидов.

Выводы

Используя полученный инструментарий, можно генетически изменить растение методом агробактериальной трансформации.

Перспективы использования результатов работы

Созданную генетическую конструкцию можно использовать для получения генетически модифицированных растений, способных к индуцибельной экспрессии флуоресцентного белка в присутствии соединений тяжёлых металлов.

Сотрудничество с вузом при создании работы

МФТИ

Мнение автора

«Я очень признательна, что смогла принять участие в конференции «Старт в медицину». Я получила новый опыт, который поможет мне в будущей научной деятельности. Была рада услышать мнение экспертов о моём исследовании. В ходе работы я узнала очень много о генной инженерии, получила навыки работы в научной лаборатории и хотела бы работать в этой области в будущем»