Разделение антибиотиков ванкомицина гидрохлорида и эремомицина сульфата с помощью метода гидрофильной хроматографии

Актуальность

Антибиотики вошли в жизнь людей в ХХ веке, благодаря им человечество получило надежду на излечение от многих смертельных для того времени болезней. Они уверенно занимают одно из главных мест среди способов борьбы с разного рода заболеваниями. Объёмы производства антибиотиков достаточно велики, кроме того, постоянно ведётся разработка новых лекарственных препаратов, поэтому возникает необходимость в разработке и совершенствовании аналитических методов, обеспечивающих качество выпускаемой фармацевтической продукции. Чистота лекарственного средства влияет на его фармакодинамику и фармакокинетику, т. е. на всасывание, распределение и выведение препарата из организма человека, поэтому проблема разделения смесей и получения чистых веществ особенно важна. Учитывая специфику отрасли и масштабы производства, анализ должен быть экспрессным, высокоточным, дешёвым и простым в плане пробоподготовки.

Цель

Подобрать современный и эффективный метод разделения антибиотиков ванкомицина гидрохлорида и эремомицина сульфата, который можно использовать в промышленных масштабах.

Задачи

1. Изучить литературу по теме исследования.

2. Ознакомиться с методами разделения смесей, ориентируясь на хроматографию.

3. Подобрать метод разделения исследуемой смеси.

4. Получить экспериментальные данные, обработать их математически.

5. Проанализировать полученные результаты.

6. На основе результатов разработать методику разделения смеси антибиотиков.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Система ВЭЖХ, состоящая из хроматографа UltiMate 3000 с двухканальным градиентным насосом, автоматической системой ввода пробы, термостатом колонки, диодно-матричным и ультрафиолетовым детектором

• Сорбенты Luna® HILIС, YMC Pack Polyamine II, сорбент Б, сорбент Б-ПЭИ

• Весы аналитические Explorer Pro

• ПК с программным пакетом Chromeleon 6.8.

• Лабораторная посуда

• Химические реактивы (ацетат аммония, ацетонитрил, кислота уксусная ледяная 95,5%, ванкомицина гидрохлорид (АО «Красфарма», Россия), эремомицина сульфат («БиоХиммак СТ», Россия)

Описание

Исследование состояло из 4 этапов, в ходе которых выбирались неподвижная фаза, pH подвижной фазы, режим элюирования, а также концентрация буферного раствора.

В работе изучили удерживание антибиотиков ванкомицина и эремомицина на четырёх сорбентах, предназначенных для разделения в режиме ГИХ (гидрофильная хроматография): коммерческих сорбентах и их аналогах, синтезированных в лаборатории. Анализ ванкомицина проводился в следующих условиях: подвижная фаза – 100 мМ ацетатно-аммонийный буферный раствор в смеси с CH₃CN (30:70 об. %); скорость потока – от 0,4 до 1 мл/мин; температура колонки +25 °С; УФ детектирование при 282 нм. Согласно данным по анализу ванкомицина было принято решение использовать сорбент Б в качестве неподвижной фазы, так как у него наблюдалось наименьшее число плохих форм пика.

Затем выбрали pH подвижной среды. В описанных выше условиях анализа при pH 6,2 наблюдалось оптимальное соотношение формы пика и эффективности. Эремомицин анализировался в схожих условиях. Для того чтобы обеспечить приемлемые значения времени удерживания, одновременно с высокой эффективностью и разделением от примесей использовался градиентный режим элюирования при фиксированном pH ацетатно-аммонийного буферного раствора 6,2. Было показано существенное различие с изократическим режимом при фиксированном соотношении ацетонитрила и ацетатно-аммонийного буферного раствора (60:40 об. %)

Хроматограммы эремомицина (200 мг/л) при изократическом (А) и градиентном (B) режимах элюирования

На последнем этапе оптимизировали концентрацию буферного раствора.

Результаты

Лучший результат получили при ранее использовавшейся концентрации буферного раствора 100 мМ, т. к. при меньших концентрациях примеси не разделялись с определяемым веществом, наблюдалось размывание пиков.

Таким образом, были выбраны следующие условия хроматографического определения ванкомицина и эремомицина:

• Сорбент Б

• Подвижная фаза: CH₃CN (А) – 100мМ ацетатно-аммонийный буферный раствор; pH 6,2; градиентное элюирование

• Скорость потока 1,0 мл/мин, температура колонки +25 °С, УФ 282 нм.

В приведённых условиях были построены градуировочные зависимости для определения указанных антибиотиков в области как высоких, так и низких концентраций.

Хроматограмма ванкомицина (А) и эремомицина (В) (5 мг/л)

Выводы

1. С помощью метода ГИХ удалось эффективно разделить антибиотики.

2. Выбраны оптимальные условия определения гликопептидных антибиотиков ванкомицина и эремомицина.

Перспективы использования результатов работы

Разработанную методику разделения гликопептидных антибиотиков можно использовать в достаточно широких масштабах. Внедрение данной методики приведёт к повышению чистоты лекарственных средств, которые, в свою очередь, станут более эффективными.

Сотрудничество с вузом при создании работы

МГУ им. М. В. Ломоносова, лаборатория хроматографии кафедры аналитической химии химического факультета.

Награды/достижения

XIV городская научно-практическая конференция на английском языке «Петровские чтения: язык – основа национальной идентичности и средство межнационального общения», секция «Естественные науки» – победитель.

Мнение автора

«Проект «Медицинский класс в московской школе» – уникальная возможность для детей в будущем связать свою жизнь с медициной. Педагоги прикладывают огромные усилия и всегда готовы помочь ученикам с самореализацией. Учась в школе, я прошла обучение в колледже и получила специальность младшего фармацевта. Именно тогда я поняла, что хотела бы принять участие в конференции «Старт в медицину» в секции «Химия в фармации и в медицине», а в дальнейшем связать свою профессиональную деятельность с таким направлением, как фармация. До поступления в медицинский класс я могла лишь мечтать об исследовательской работе такого уровня, но сейчас мечта стала реальностью»