Получение моноклональных антител против антигенов микобактерий из Micobacterium tuberculosis complex

Актуальность

Туберкулёз – это широко распространённое инфекционное заболевание, вызываемое различными видами микобактерий из группы Мycobacterium tuberculosis complex. Чаще всего заболевание затрагивает лёгкие, но также возможно поражение других органов. Основными симптомами туберкулёза лёгких являются слабость, высокая температура, ночная потливость, потеря аппетита и веса, длительный кашель с мокротой, а на поздних стадиях с кровью. Лечение туберкулёза требует комплексного подхода. Основная проблема состоит в том, что чаще всего заболевание диагностируется уже при появлении клинических признаков. Моноклональные антитела против специфичных антигенов микобактерий могут помочь в диагностике туберкулёза на ранних стадиях развития заболевания.

Цель

Получить моноклональные антитела против специфичного антигена микобактерий, которые помогут диагностировать туберкулёз в биологических жидкостях человека на ранних стадиях заболевания.

Задачи

1. Провести анализ литературы по теме исследования.

2. Экспериментальным путём получить моноклональные антитела.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Пластиковые пробирки

• Пипетки Пастера

• Стерильный бокс

• Автоматические пипетки

• Дозаторы

• Чашки Петри

• Спектрофотометр

• Шейкер

• Стрипы

• Планшет с гибридомами

• CO₂-инкубатор

• Бинокулярный микроскоп

• Холодильник

• Пинцет

• Центрифуга

• Гомогенизатор

• Центрифужные пробирки

• Весы

• Шприц

• 96-луночный планшет

Описание

Работа проводилась в лаборатории иммунохимии ЦНИИ туберкулёза.

На первом этапе были приготовлены сыворотки крови мышей BALB/c и проведён иммуноферментный анализ, в результате чего выбрали антиген, с которым идёт наибольшее взаимодействие – 38кДа.

На следующем этапе был сделан двухсайтовый иммуноферментный анализ, на основе которого была выбрана мышь для дальнейшего исследования. Анализ выполнялся так же, как и обычный иммуноферментный анализ, но изначально на планшет добавляли не антигены, а антитела. В итоге получается комплекс антитело-антиген-антитело.

Затем провели иммунизацию мыши (в животное ввели выбранный антиген) и иммуноблоттинг, для того чтобы убедиться, что мышь отвечает на искомый антиген и иммунный ответ усиливается после вторичной иммунизации.

На следующем этапе создали гибридомы (процесс гибридизации), которые должны продуцировать моноклональные антитела.

На заключительном этапе проведена серия контрольных иммуноферментных анализов, которые позволили проверить, продуцируют ли гибридомы нужные моноклональные антитела.                  

                                         Гибридома                                                            Гибридомы в CO₂-инкубаторе

Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, были отсажены во флаконы и помещены в СО₂-инкубатор.

Результаты

С помощью гибридомной технологии получены новые моноклональные антитела (МАТ) 2C10 и 2D4C1 против микобактериального антигена 38кДа.

После обработки суспензии цельных клеток Мycobacterium tuberculosis протеиназой К связывание с полученными МАТ в ИФА отсутствовало, что говорит о том, что искомые протеазоустойчивые эпитопы либо экранированы, либо имеют комплексную детерминанту, включающую соединения небелковой природы. Подобный результат объясняется тем, что иммунизация проводилась чистым рекомбинантным белком 38кДа, а не нативным гликолипопротеином.

Перспективы использования результатов работы

Дальнейшие гибридизации против выделенного из Мycobacterium tuberculosis антигена 38 кДа позволят получить новые моноклональные антитела против протеазоустойчивых эпитопов, пригодных для создания теста в двухсайтовом ИФА.

Полученные моноклональные антитела могут использоваться в лаборатории.

Сотрудничество с учреждением при создании работы

ФГБНУ «ЦНИИТ»

Мнение автора

«Я считаю, что конференция «Старт в медицину» позволяет раскрыть учащимся свой потенциал в процессе выполнения работы и помогает развить самостоятельность, т. к. участники проделывают очень серьёзную работу».