Исследование уровня экспрессии протоонкогена с-Myc в клинических образцах новообразований щитовидной железы

Актуальность

Рак щитовидной железы (РЩЖ) – наиболее часто встречающаяся злокачественная опухоль эндокринных органов. Доля РЩЖ среди злокачественных опухолей всех локализаций составляет 1–1,5%. Ежегодный прирост заболеваемости РЩЖ в различных странах мира варьирует от 2 до 12%. В Российской Федерации в последние годы заболеваемость РЩЖ лидирует по ежегодным темпам прироста, который составляет в среднем 3,5% в год и ежегодно 6,1 случаев на 100 тыс. населения. Эффективность терапии заболевания напрямую зависит от распространённости опухолевого процесса, поэтому первостепенное значение имеет проблема усовершенствования существующих и внедрения новых методов ранней дооперационной диагностики. Предполагается, что в качестве потенциального маркера РЩЖ у больных неаутоиммунными заболеваниями щитовидной железы может использоваться экспрессия протоонкогена c-Myc.

Цель

Проанализировать уровень экспрессии протоонкогена с-Myc в клинических образцах новообразований щитовидной железы (ЩЖ).

Задачи

1. Провести ОТ/ПЦР для образцов клеточной РНК, полученных из новообразований щитовидной железы.

2. Провести электрофорез продуктов ОТ/ПЦР.

3. Окрасить, сфотографировать и провести анализ изображений геля после электрофореза.

4. Сделать выводы об уровне экспрессии протоонкогена с-Myc в клинических образцах новообразований щитовидной железы.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Лабораторный блок для проведения ПЦР

• Установка для электрофореза нуклеиновых кислот

• Система гель-документирования Syngene G:BOX

• Компьютер с ПО GeneTools 4.3.8

• Химическая посуда

• Химические реагенты

Описание

Материалом для исследования служили образцы тканей ЩЖ 55 пациентов, проходивших обследование и лечение в клинике факультетской хирургии им. Н. Н. Бурденко Сеченовского Университета.

Исследовались уже готовые образцы клеточной РНК, полученной из биоптатов пациентов с новообразованиями щитовидной железы, прошедшие стадию обратной транскрипции (стадия ОТ: получение кДНК на РНК-матрицах) и температурную обработку при +95 °C.
Далее амплифицировали уже одноцепочечную молекулу кДНК, используя традиционную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с па́рами олигонуклеотидных праймеров, специфичных первичной структуре ДНК исследуемых генов. Используемые пары праймеров в ПЦР давали специфические ампликоны с кДНК и не образовывали специфических ПЦР-продуктов с геномной ДНК.

Реакцию ПЦР проводили в смеси конечным объёмом 50 мкл, содержащей буферный раствор на основе Трис-HCl (рН 8,8), смесь dNTP (по 0,2 мМ каждого), 15 пкмоль каждого из пары праймеров, 2,5 ед. рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы, 5 мкл реакционной ОТ-смеси, содержащей кДНК. В качестве положительного контроля в реакциях ПЦР с праймерами к гену c-Myc была использована кДНК, полученная к тотальной РНК, выделенной из клеток линии меланомы человека Bro.

Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2%-м агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия.

Гели снимали на цифровую фотокамеру в системе гель-документирования Syngene G:BOX и проводили анализ изображения на компьютере с помощью программного обеспечения GeneTools 4.3.8. 

Уровни экспрессии исследуемых генов нормализовали по отношению к уровню экспрессии конститутивного гена (β-актина), который принимали за единицу (отн. ед.).

Уровень экспрессии исследуемого гена ниже 0,15 отн. ед. расценивали как очень низкий, от 0,15 до 0,29 отн. ед. – низкий, от 0,3 до 0,54 отн. ед. – средний, от 0,55 до 0,99 отн. ед. – высокий, выше 1 отн. ед. – очень высокий (гиперэкспрессия).

Для анализа достоверности различий в относительных уровнях экспрессии исследуемого гена между группами новообразований ЩЖ использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Различия считались статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты

Анализ экспрессии гена-онкомаркера проводили с помощью совмещённых реакций обратной транскрипции и ПЦР. На фотографии видны уровни экспрессии протоонкогена с-Mус в клинических образцах новообразований щитовидной железы и конститутивного гена (β-актина). Наблюдаются статистически значимые различия в относительных уровнях экспрессии мРНК с-Мус в группах пациентов с различными новообразованиями ЩЖ.

Таким образом, различия в уровнях экспрессии гена c-Myс в клиническом материале пациентов с различными неаутоиммунными новообразованиями ЩЖ могут служить критерием, указывающим на развитие РЩЖ.

Относительный уровень экспрессии протоонкогена с-Myc в клинических образцах новообразований щитовидной железы

Выводы

1. Обнаружено, что в дифференцированных карциномах щитовидной железы наблюдается тенденция к повышению экспрессии генов c-Myc по сравнению с группами новообразований ЩЖ: фолликулярной аденомы (ФА) и коллоидного зоба (КЗ).

2. В качестве потенциальных маркеров рака ЩЖ у больных неаутоиммунными заболеваниями ЩЖ (ФА и КЗ) могут быть использованы c-Myc.

3. При аутоиммунном тиреоидите наблюдался высокий уровень экспрессии мРНК с-Мус, соизмеримый с уровнем экспресии при РЩЖ.

Перспективы использования результатов работы
Анализ уровня экспрессии протоонкомаркера c-Myc методом ОТ-ПЦР может быть использован как дополнительный критерий злокачественности при дифференциальной диагностике неаутоиммунных новообразований ЩЖ.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), кафедра биологической химии