Исследование патогенеза атеросклероза на примере выборки из Московского региона

Актуальность

Широкая распространённость атеросклероза в ХХI веке остаётся одной из главных проблем здравоохранения индустриально развитых стран. В структуре заболеваемости и смертности этих стран болезни, связанные с атеросклерозом, занимают долю, большую, чем все злокачественные заболевания, травмы и несчастные случаи вместе взятые.

Атеросклероз длительное время определяли как болезнь цивилизации и образа жизни, что подтверждается многочисленными исследованиями. Рост числа фатальных осложнений атеросклероза остаётся одной из самых актуальных и нерешённых задач медико-биологической науки. Наличие аллеля Pro значительно увеличивает риск развития гиперлипопротеинемии III типа, характеризующейся повышенным уровнем холестерина и триглицеридов в крови, что является одной из главных причин развития заболевания.

Цель

Определить взаимосвязь состояния аллелей гена АРОЕ человека с прогнозом развития атеросклероза.

Задачи

1. Провести анализ научной литературы по теме исследования: изучить современный взгляд на течение заболевания, информацию по предотвращению развития заболевания.

2. Провести выборку людей с клиническими проявлениями сопутствующих заболеваний.       

3. Провести экспериментальное исследование (работа с биоматериалом, генетический анализ выборки).

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Комплект реагентов для экспресс-выделения ДНК

• Вихревой смеситель (вортекс)

• Термостат

• Центрифуга

• Дозаторы переменного объёма

• Амплификатор ДТ-лайт

• Набор реагентов SNP-экспресс

Описание

Собрав информацию о причинах, клинической картине и методах лечения атеросклероза, автор приступил к исследованию замены однонуклеотидного полиморфизма (отличия последовательности ДНК размером в один нуклеотид) гена APOE Leu28Pro. Для анализа были взяты образцы буккального соскоба эпителия 21 пациента в возраст 45+. У всех исследован полиморфный генетический маркер развития атеросклероза. Выделение ДНК и анализ полиморфных маркеров генов осуществлялись на базе ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России. Образцы ДНК выделены с помощью «Комплекта реагентов для экспресс-выделения ДНК из буккального соскоба» (кат. № 0204).
Принцип метода системы «SNP-экспресс-РВ» представляет собой комплект реагентов для выявления мутаций (полиморфизмов) в геноме человека. Анализу подвергается геномная ДНК с помощью реагента «ДНК-экспресс». С образцом выделенной ДНК параллельно проводятся две реакции амплификации – с двумя парами аллель-специфических праймеров.  Результаты анализа позволяют дать три типа заключений: гомозигота по аллели 1; гетерозигота; гомозигота по аллели 2. Полиморфизм гена APOE был амплифицирован в результате полимеразной цепной реакции (ПЦР).  

Из компонентов комплекта приготовили рабочие смеси реагентов для амплификации из расчёта на 1 пробу: 17,5 мл разбавителя 280; 2,5 мл реакционной смеси 40; 0,2 мл красителя SYBRGreen3,2; 0,2 мл Taq-полимераза 3,2.

Приготовили две рабочие смеси с реакционной смесью аллель 1 и с реакционной смесью аллель 2. Все компоненты добавляли отдельными наконечниками с аэрозольными барьерами. После добавления Taq-полимеразы (проводится в последнюю очередь) смесь тщательно перемешали пипетированием. Затем внесли соответствующую рабочую смесь во все соответствующие пробирки и образцы из обработанной анализируемой пробы в пробирку с рабочей амплификационной смесью аллель 1 и в пробирку с рабочей амплификационной смесью аллель 2.  В качестве отрицательного контрольного образца внесли разбавитель в оба типа реакционной смеси. Пробирки закрыли и центрифугировали в течение 5 секунд при 3000 об/мин.

Результаты

1. Были получены генетические варианты исследуемого полиморфизма у группы исследуемых. Leu/Leu (лейцин/лейцин) – это результат, при котором у человека варианты нормального (так называемого дикого) типа. Leu/Pro (лейцин/пролин) – это результат гетерозигот: ген содержит одну нормальную аллель (дикого типа) и одну мутантную аллель, которая как раз будет оказывать влияние на конформацию белка и изменение его функций.

2. Создана таблица, в которой рядом с номером каждого образца записан генетический вариант исследуемого полиморфизма у конкретного пациента.

3. Были выявлены 4 пациента, чья ДНК содержала   прогностически неблагоприятный гетерозиготный Leu28Pro генотип, повышающий риск нарушения липидного обмена.

Выводы

1. В результате исследования была установлена взаимосвязь между генетическим профилем исследуемых и риском заболевания.

2. Результаты исследования доказали, что наличие в ДНК неблагоприятного гетерозиготного Leu28Pro генотипа повышает риск возникновения липидного обмена и развития атеросклероза.

3. Исследования по Leu28Pro полиморфизму гена АРОЕ в основном направлены на анализ их ассоциации с нарушением липидного обмена и, как следствие, с развитием сердечно-сосудистых заболеваний. Пациенты, предрасположенные к функциональным отклонениям в работе сердечно-сосудистой системы, имеют более высокую частоту «мутантной» 28Pro аллели. При наличии 28Pro риск вероятности развития ишемической болезни сердца повышается в 5,3 раза.

Перспективы использования результатов работы

Данное исследование поможет выявить склонность к атеросклерозу на генетическом уровне и разработать меры по профилактике заболевания.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России

Мнение автора

«Проект «Медицинский класс в московской школе» позволяет учащимся осознанно сделать свой выбор профессии. Конкурс проектов и исследований «Старт в медицину» дал мне возможность погрузиться в мир научных исследований, познакомиться с интересными людьми»