Анализ уровня теломеразной активности в лизатах опухолевых клеточных линий SKOV3 и K562

Актуальность

Проблема поиска новых методов ранней диагностики опухолевых заболеваний является в настоящее время одной из наиболее актуальных в современной онкологии. Возможность выявления опухоли на ранней стадии её развития значительно упрощает последующую терапию заболевания и улучшает прогноз для пациента. Использование в клинической практике анализа на специфические компоненты опухолевой ткани – онкомаркеры – представляется сегодня одним из решений данной проблемы. Биохимический анализ, обладая высокой чувствительностью и специфичностью, позволяет не только определить наличие в исследуемом материале клеток опухоли, но и, очень часто, прогнозировать её развитие. Проблемой является поиск универсального онкомаркера.

Теломераза – это уникальный для человеческого организма фермент, обратная транскриптаза, который является ключевым в поддержании стабильности генетического аппарата клетки в процессе многократного её деления. Так как теломераза часто активирована у большинства видов опухолей (85% опухолей содержат активную теломеразу), информация о состоянии теломеразной активности (АТ) может иметь клиническое значение в скрининге рака, постановке диагноза и контроле эффективности лечения.

Цель

Провести исследование по анализу чувствительности неизотопной модификации метода TRAP на теломеразапозитивных клеточных линиях.

Задачи

1. Проанализировать АТ при добавлении в реакцию различного количества белкового лизата, полученного из теломеразапозитивных клеточных линий.

2. Осуществить разделение полученных фрагментов ДНК методом электрофореза.

3. Провести цифровую обработку изображений электрофорезного геля и проанализировать данные.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• Лабораторный блок для проведения ПЦР

• Установка для электрофореза нуклеиновых кислот

• Система гель-документирования Syngene G:BOX

• Компьютер с ПО GeneTools 4.3.8

• Химическая посуда

• Химические реагенты

Описание

В работе использовались лизаты, предоставленные кафедрой биологической химии Сеченовского Университета.

Определение активности теломеразы проводили модифицированным методом TRAP с добавлением различных концентраций белковых лизатов опухолевых клеток линий K562 и SKOV3. Метод TRAP основан на ПЦР-амплификации продуктов теломеразной реакции, полученных при удлинении ферментом специфического праймера. Метод состоит из двух этапов: сначала к лизату клеток добавляется олигонуклеотидный субстрат (TS-праймер), который при наличии в лизате активной теломеразы удлиняется за счёт присоединения ферментом теломерных последовательностей к 3’-концу субстрата, затем удлинённый олигонуклеотид амплифицируется методом ПЦР.

Разделение амплификационных продуктов (TRAP-продукты) осуществляли методом электрофореза в 10%-м неденатурирующем полиакриламидном геле. Образцы после ПЦР вносили в лунки геля, предварительно смешав их с лидирующим красителем Orange G. Электрофорез проводили в течение 20 мин. при напряжённости электрического поля 36 В/см. Визуализацию проводили на УФ-трансиллюминаторе (λ=300 нм) после окрашивания геля в течение 30 мин. в растворе красителя SYBR Gold.

Затем окрашенные гели фотографировали. Полученные цифровые фотографии оценивали с помощью специализированной программы для анализа изображений, которая рассчитывает площади пиков (в условных единицах), соответствующих интенсивности свечения в геле дискретных фрагментов TRAP-продуктов. Суммарная площадь пиков принималась за величину АТ в конкретном образце. Далее рассчитывали относительную АТ, сравнивая с положительным контрольным образцом – экстрактом, полученным из клеток теломеразапозитивной опухолевой линии, эквивалентным 100 опухолевым клеткам и содержащим 0,04 мкг белка. Теломеразная активность в контрольном образце принималась за единицу (100%).

Результаты

1. Теломеразапозитивные модельные клеточные линии имеют различное тканевое происхождение. В связи с этим содержание теломеразы в расчёте на клетку в этих клеточных линиях может варьироваться. Это будет отражаться на общей АТ при анализе лизатов. На основании этого провели анализ АТ в лизатах, полученных из различного количества клеток линий.

Результаты анализа активности теломеразы в клеточных лизатах линий SKOV3 и K562

2. Уровень АТ в лизатах из 200 клеток для линии K562 существенно превосходит АТ для линии SKOV3 (дорожки 1(Б) и 6(А). При этом чувствительность неизотопного метода TRAP для линии K562 составила не менее двух теломеразапозитивных клеток (дорожка 8(Б).

3. При анализе АТ в лизатах клеточных линий наблюдалось значительное повышение процессивности теломеразы при уменьшении количества клеток (белка) в исследуемых лизатах. При этом данный эффект был более выражен для линий К562. Процессивность теломеразы начинала возрастать в лизатах, эквивалентных 62 клеткам (0,015 мкг белка) для линии SKVO3 (дорожки 7(A) и 8(A), 50 клеткам (0,02 мкг белка) – для линии К562 (дорожки 2(Б) и 3(Б). Видно, что при существенной разнице в содержании количества клеток в лизатах, с которых начинается заметное увеличение процессивности теломеразы, количество белка в этих лизатах для всех клеточных линий практически одинаково. При компьютерной обработке изображений гелей с TRAP-продуктами было установлено, что АТ в лизате, эквивалентном 100 клеткам (0,04 мкг белка) линии К562 (положительный контроль – K+), соответствует АТ в лизате из 250 клеток (0,06 мкг белка) линии SKOV3 (дорожки 6(А) и 9(А). Таким образом, наиболее теломеразапозитивной клеточной линией (в отношении АТ) можно считать линию К562.

Вывод

Наиболее теломеразапозитивной клеточной линией (в отношении активности теломеразы) можно считать линию К562, т. к. для анализа АТ в клинических образцах пациентов с различными онкопатологиями требуется высокая чувствительность.

Перспективы использования результатов работы
Клеточную линию K562 можно использовать в качестве положительного контроля, который будет использоваться в дальнейшем для нормализации значений активности теломеразы в клинических образцах от пациентов с различными онкопатологиями.

Сотрудничество с вузом при создании работы

ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), кафедра биологической химии

Награды/достижения

II Городская Сеченовская конференция проектных и исследовательских работ школьников – победитель.

Мнение автора

«Конференция «Старт в медицину» подарила мне возможность показать свои таланты в направлении «Биохимия». Моя работа была высоко оценена жюри. Я и дальше буду развивать свой проект, и, надеюсь, в будущем он поможет медицине!»