Подбор условий и сред для оптимального набора биомассы бактерий при продукции белка

Актуальность

Около половины населения Земли испытывает недостаток в пище. Это в первую очередь относится к развивающимся странам, в которых люди получают в 2 раза меньше растительного белка и в 5 раз меньше белков животного происхождения, чем в высокоразвитых странах. Российская Федерация по производству пищевых белковых продуктов входит в группу высокоразвитых стран, нуждающихся в производстве больших объёмов пищевых продуктов. Увеличение продукции белка может решить ряд экономических и научных проблем. Получение методик эффективного синтеза белка способно помочь в решении проблем голода в развивающихся странах и увеличить эффективность фундаментальных и коммерческих исследований.

Цель

Подбор условий и сред, обеспечивающих оптимальный набор биомассы бактерий при продукции белка.

Задачи

1. Провести сравнение условий и бактериальных сред для продукции белка в клетках различных штаммов Escherichia coli.

2. Оценить продуктивность синтеза белка методом SDS-PAGE электрофореза.

3. Провести анализ полученных результатов и выделить оптимальные условия.

Оснащение и оборудование, использованное в работе

• SDS-PAGE-электрофорез

• Автоклав Tutnover

• Шпатель Дригальского

• Водный термостат

• Термостатируемый шейкер

Описание

Для решения задач исследования в качестве модельных образцов для отработки экспрессии белков автором были выбраны тропонин С (TnC) и фрагмент миозинового белка С (cMybpC). Продукция белков производилась в клетках Escherichia coli (E. coli).

Работа выполнялась в 4 этапа.

На первом этапе автором проводилась трансформация клеток E. coli штаммов C41 (DE3) и BL21 (DE3) с помощью плазмид, содержащих молекулярно-генетические конструкты целевых белков.

На втором этапе были приготовлены 6 вариантов питательных сред: LB (Луриа Бертани), LB + HEPES, LB+Glucose, LB+Glucose + HEPES, SOC, SOC + HEPES. Все среды были стерилизованы с использованием автоклава для избежания неспецифического бактериального зароста.  

На 3 этапе автором была проведена экспрессия белков TnC и cMybpC в клетках E.coli с использованием следующей схемы:

1. По одной колонии бактерий из каждой чашки Петри после трансформации были перенесены в 30 мл питательной среды LB и оставлены на ночь при интенсивном перемешивании при 37 °С.

2. Затем взяли 24 пробирки на 15 мл для перебора различных условий для каждого типа клеток с целевыми молекулярно-генетическими конструктами: cMybpC-C41, cMybpC-Bl21, TnC-C41, TnC-BL21. Клетки (100 мкл) перенесены в 7 мл свежих предварительно разлитых питательных сред и оставлены при постоянном перемешивании при 37 °С на 2 часа. Автор отбирал по 1 мл суспензии из каждой пробирки и измерял оптическую плотность культуры при 600 нм. При достижении плотности культуры 0,6 единиц был добавлен индуктор синтеза белка IPTG до 1 мМ. После этого пробирки были оставлены при постоянном перемешивании при 37 °С. Во время синтеза белковых продуктов отбирали по 1 мл проб из каждой бактериальной культуры через 1 час 30 мин, 3 часа и 24 часа.

4 этап работы. Результаты экспрессии проанализировали с помощью электрофореза белковых молекул, по окончании которого гели были окрашены красителем Coomassie G250 в течение 20 минут и отмывались от избытка краски кипячением в дистиллированной воде.

Результаты

1. В результате проведённой работы было изучено 24 вида различных условий среды при культивировании клеток.

2. Автор варьировал время экспрессии белковых молекул, различные виды сред, штаммов бактериальных клеток и компонентов, таких как: глюкоза и буфер 30 мМHepes-NаpH= 7,3. Установлено, что не все подобранные условия показали необходимую эффективность.

3. В среде SOC практически не экспрессировался фрагмент cMybpC. TnС показывал слабый уровень экспрессии или она вообще отсутствовала практически в любых условиях при экспрессии в клетках C41 (DE3).

4. В результате суточного наблюдения было установлено, что клетки Bl21 плохо подходят для экспрессии выбранных автором белков. В используемых условиях они плохо набирали биомассу и не росли до нужных значений плотности. Поэтому в дальнейшем эксперименте они не использовались. Клетки С41 оказались более пригодными для экспрессии выбранных молекул.

5. При оптимальных условиях экспрессии целевой белок накапливался в клетках, что выражалось в увеличении плотности полосы целевого белка на геле.

Пример результатов после электрофореза белков

Пробирка № 1 – cMybpC C41 в LB+1mM IPTG

Пробирка № 3 – TnC C41 в LB+1mM IPTG

Пробирка № 5 – cMybpC C41 в LB+Hepes+1mM IPTG

Выводы

1. Благодаря тому, что в работе был использован широкий набор вариантов, автору удалось найти условия, в которых экспрессия белка была хорошо выражена. В ходе эксперимента было выяснено, что оптимальные условия для синтеза фрагмента сMybpC предоставляет среда LB, пустая или приготовленная на буфере при времени экспрессии не менее 3 часов.

2. Для TnC оптимальными условиями оказались синтез белка в течение дня на среде SOC или LB без дополнительных добавок.

3. SDS-PAGE электрофорез является простым и надёжным методом оценки экспрессии белка в клеточных лизатах и позволяет легко определить клетки, в которых идёт увеличенная экспрессия белка.

Перспективы использования результатов работы

Оптимизация процессов получения белковых молекул необходима во многих областях:

 – в пищевой промышленности (производство пищевых белковых продуктов);

 – в фармацевтической промышленности (продуцирование белков, необходимых для иммунизации или являющихся компонентом лекарственных препаратов);

 – для проведения фундаментальных исследований, где белки используются для изучения их структурно-функциональных особенностей.

Сотрудничество с учреждением при создании работы

ФИЦ Биотехнологии РАН

Мнение автора

«Учеба в медицинском классе открыла для меня большие возможности. Мы изучаем на углублённом уровне химию и биологию, посещаем практические занятия в медицинском колледже. Благодаря проекту у меня появилась возможность углублённо изучить интересующую меня тему. Используя возможности лаборатории ФИЦ Биотехнологии РАН, мы подготовили проект, имеющий большую практическую значимость. Конференция «Старт в медицину» – это возможность представить свой проект компетентному жюри, получить рекомендации, которые можно использовать в дальнейшем».